الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الميتوكوندريا وقياس التنفس الميتوكوندري. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل العضلات الهيكلية من جرذان Sprague Dawley. بعد ذلك، يتم تجنيس العضلات وعزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي.

يتم بعد ذلك تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد (Bradford assay). وأخيرًا، يتم قياس التنفس الميتوكوندري عن طريق تسجيلات البوليغراف. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح استهلاك الأكسجين عبر حالات التنفس الميتوكوندري المختلفة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال العضلات الهيكلية، مثل تأثير التدخلات المختلفة على الوظيفة الميتوكوندرية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول استقلاب العضلات الهيكلية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أعضاء أخرى مثل الكبد، أو الدماغ، أو الكلى، أو أي نسيج تقريباً قبل البدء في الإجراء. لعزل العضلات الهيكلية، قم بتحضير المحاليل التالية: P-B-S، وP-B-S مضافاً إليه 10 millimolar EDTA، ومحلول عزل الميتوكوندريا بتركيز ثمانية أضعاف (isolation buffer one أو IB one)، ومحلول العزل الثاني (IB two)، والمحلول التجريبي (experimental buffer أو eb).

راجع البروتوكول المكتوب المرفق للحصول على التعليمات. بعد ذلك، قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي واضبطه على 4 °C. قم بتشغيل الحمام المائي واضبطه على 37 °C.

في وعاء مناسب، ضع ثلاثة كؤوس مدرجة سعة 10 milliliter، ومطحنة potter elbow، ومطاحن أنسجة gem، ومقصات جراحية صغيرة، و10 أنابيب طرد مركزي دقيقة على الثلج. يجب أن تظل جميع الأدوات والمواد باردة جداً طوال فترة التجربة. ضع IB one وIB two على الثلج، وضع EB في حمام مائي دافئ.

ثم أضف المحاليل التالية إلى الكؤوس الثلاثة الموضوعة على الثلج: الكأس الأول 10 milliliters من PBS، والكأس الثاني 10 milliliters من P-B-S-E-D-T-A، والكأس الثالث 3 milliliters من ib. 1. قم بقتل الجرذ رحمةً وفقاً للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية المحلية لديك.

بعد ذلك، قم بعزل 250 إلى 500 مليجرام من العضلات الهيكلية بسرعة باستخدام الملاقط ومقصات مايو كلينك. اشطفها في beaker one، ثم انقلها إلى beaker two لمجانسة العضلة. أولاً، انقلها إلى beaker three، وفي النهاية قم بتقطيعها باستخدام المقصات.

انقل المحلول إلى جهاز التجانس Potter-Elva، وقم بتجانس العضلة باستخدام مدقة آلية 10 مرات، مع الحفاظ على الأنبوب في الثلج طوال الوقت. بعد ذلك، انقل المستحلب إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 mL مبردة مسبقاً، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 700 Gs لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مبرد مسبقاً وتخلص من الراسب.

يتم طرد السائل العلوي (supernatant) بسرعة 10,500 Gs لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، ثم يُنقل السائل العلوي (SNAT) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ومعد مسبقاً، ويُوضع عليه ملصق باسم SN one ونوع العضلة Reese. يتم تعليق الراسب في 500 µL من IB two، ثم يُجرى الطرد المركزي بسرعة 10,500 Gs لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. يُنقل السائل العلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ومعد مسبقاً، ويُوضع عليه ملصق باسم SN two ونوع العضلة.

قم بتعليق الراسب الميتوكوندري النهائي في 100 µL من IB two. قم بCenteredه في جهاز طرد مركزي صغير (mini fuge) لبضع ثوانٍ. في حالة وجود راسب، انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مملوء مسبقاً وتخلص من الراسب. يعد معايرة قطب الأكسجين خطوة أساسية في هذا البروتوكول ويجب إجراؤها يومياً.

يمكن إتمام معايرة القطب الكهربائي أثناء عملية عزل الميتوكوندريا. للبدء، أضف 100 milliliters من الماء المقطر إلى دورق سعة 250 milliliter وحركه بقوة لمدة 20 دقيقة. ولموازنة الماء مع الغاز الجوي، غطِّ القطب الكهربائي GRAT ببضع قطرات من كلوريد البوتاسيوم بتركيز 50%.

ضع بعد ذلك قطعة صغيرة من ورق لف السجائر الأزرق (rizla) فوق القطب الكهربائي. ثم ضع قطعة من غشاء PTFE فوق ورق اللف.

قم بتركيب الحلقة الداخلية باستخدام أداة تطبيق الحلقة، ثم ضع الحلقة الخارجية في أخدود القطب الكهربائي. صِل الأقطاب الكهربائية وقم بتجميع قاعدة الحلقة البلاستيكية الكبيرة، وغرفة الميتوكوندريا، وخراطيم المياه. قم بتشغيل صناديق GRAT وابدأ تشغيل برنامج GRAS.

أضف الماء المتوازن إلى غرفة الميتوكوندريا. ثم أضف قضيب التحريك لتشغيل جهاز التحريك. انقر فوق الأجهزة (hardware).

بعد ذلك، قم بالتقليب بسرعة معينة. اضبط السرعة على 60 ثم انقر على زر التشغيل. بعد ذلك، ابدأ تجربة جديدة.

انقر على معايرة (calibrate) ثم معايرة الطور السائل (liquid phase calibration). بالنسبة للمربع الأول، قم بتغيير درجة الحرارة إلى 37 °C وانقر موافق (okay) مرتين. عندما تتغير حالة التجاوز (override) إلى موافق (okay)، انقر عليها وافتح خزان غاز النيتروجين.

ضع الطرف المتصل بخزان النيتروجين داخل الغرفة لتحقيق نسبة صفر أكسجين. انقر "موافق" عندما تتحول الحالة من التجاوز (override). قم بشفط الماء وأضف 500 µL من EB إلى غرف الميتوكوندريا.

أحكم إغلاق الحجرة باستخدام سدادة. في حال استخدام عدة صناديق، كرر الخطوات بدءاً من مرحلة المعايرة لكل صندوق. ابدأ تجربة جديدة واتركها تعمل لمدة دقيقة واحدة تقريباً.

لتثبيت الإشارة، أضف الحجم اللازم من معلق الميتوكوندريا للوصول إلى 150 micrograms في كل حجرة. حدد الحدث واتركه يعمل. ولمدة دقيقة واحدة، أضف 10 microliters من glutamate بتركيز 250 millimolar وmalate بتركيز 125 millimolar دافئين، للوصول إلى تركيز نهائي قدره 5 millimolar من glutamate و2.5 millimolar من malate، ثم حدد العلامة واتركه يعمل لمدة دقيقة واحدة.

يُعرَّف هذا بأنه الحالة الثانية. بعد ذلك، أضف 7.5 µL من 10 mM a DP للوصول إلى تركيز نهائي قدره 150 µM. ثم قم بالتحديد واتركه يعمل لمدة 30 ثانية.

يُعرَّف هذا بأنه الحالة الثالثة. أضف 7.5 µL أخرى من 10 mM ADP، واترك الجهاز يعمل لمدة 1.5 دقيقة. أضف 0.5 µL من 10 mM oligomycin البارد للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 µM، واترك الجهاز يعمل لمدة ثلاث دقائق.

يُعرف هذا بأنها الحالة الرابعة. أضف 1 µL من FCCP البارد بتركيز 0.1 mM ليصل التركيز النهائي إلى 0.2 µM، واترك الجهاز يعمل لمدة ثلاث دقائق. يُعرف هذا بأنها الحالة الخامسة.

عند الانتهاء، قم بإيقاف التجربة وحفظها. استخرج معدلات التنفس باستخدام برنامج raft. أدخل عامل التسوية.

في حال إضافة 150 micrograms من البروتين الميتوكوندري، سيكون عامل التسوية 0.15. قم بحساب معدلات التنفس المنسقة لمختلف حالات التنفس. احسب نسبة التحكم التنفسي أو RCR عن طريق قسمة الحالة الثالثة على الحالة الرابعة.

يوضح هذا الشكل تخطيطاً نموذجياً لاستهلاك الأكسجين بواسطة ميتوكوندريا العضلات الهيكلية. بعد استقرار إشارة القطب الكهربائي، تُضاف عينة الميتوكوندريا إلى غرفة GRAT. في الحالة الثانية، يبدأ التنفس بعد إضافة الغلوتامات والمالات.

تؤدي إضافة ADP إلى زيادة استهلاك الأكسجين. تعريف الحالة الثالثة. يتم حجب تنفس ATP syntase عن طريق إضافة oligomycin للحصول على تنفس الحالة الرابعة.

وأخيراً، يُضاف FCCP لفك ارتباط التنفس الميتوكوندري. يوضح هذا المخطط معدلات استهلاك الأكسجين النموذجية للحالات 2 و3 و4 و5. كما يتم حساب نسبة التحكم التنفسي أو RCR لكل تجربة.

تُعتبر نسبة RCR التي تزيد عن أربعة دليلاً على تحضير ميتوكوندريا قابل للحياة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الاحتفاظ بعينات الميتوكوندريا في الثلج في جميع الأوقات. بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل لطخة ويسترن (Western blots) من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل محتوى البروتينات الميتوكوندرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الميتوكوندريا من العضلات الهيكلية وكذلك التنفس الميتوكوندري.