شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المستعمرات التي تعبر عن إنزيم السليولاز (cellulase) من مكتبة ميتاجينومية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق نسخ مكتبة ميتاجينومية تم إعدادها مسبقاً باستخدام روبوت، وذلك بعد تحضين المكتبة المنسوخة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 24 ساعة. ثم يتم قياس نمو مستعمرات e coli، وإضافة محلول التحلل والمنظم والمادة الركيزة إلى المكتبة المنسوخة.

في النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر نشاط السليوليز (cellulase) من خلال قياسات الامتصاص اللوني باستخدام قارئ الأطباق. مرحبًا، أنا كيث من مختبر ستيفن هالام في قسم الميكروبيولوجيا والمناعة بجامعة كولومبيا البريطانية. سنعرض لكم اليوم إجراءً للفحص الوظيفي عالي الإنتاجية للمكتبات الميتاجينومية.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة نشاط إنزيم السليوليز الحيوي من المكتبات الميتاجينومية. لذا، فلنبدأ. قبل البدء في هذا البروتوكول، قم بتجهيز مكتبة ميتاجينومية محفوظة في تنسيق لوحة ذات 384 بئراً.

استخدمت هذه الدراسة ناقل PCC one copy control SMID بالاشتراك مع خلايا E. coli من سلالة Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant كمضيف للمكتبة. لبدء هذا الإجراء، أخرج الأطباق التي تحتوي على المكتبة من درجة حرارة 80- درجة مئوية واتركها لتذوب عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريباً. وفي هذه الأثناء، استخدم خاصية التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية (UV) في جهاز QIX two لتعقيم الروبوت لمدة 15 دقيقة. قم بإعداد جهاز Q fill three وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة مع توصيل زجاجة الوسط بالمنشعب عبر أنابيب التعقيم المبرمجة.

قم بتعبئة جهاز Q fill three بالكمية المناسبة من الوسط الغذائي، واضبطه لتعبئة حجم 45 microliter. في كل بئر، قم بتفريغ الهواء من الأنابيب والمجمّع باستخدام ميزة التطهير (purge) في الروبوت حتى يصبح الوسط الغذائي مرئياً. وعند كل دبوس في المجمّع، قم بتعبئة العدد المطلوب من الأطباق بوسط LB باستخدام جهاز Q fill three.

يستغرق ملء كل طبق حوالي 20 ثانية. بعد ذلك، قم بتحميل أطباق المكتبة والأطباق الجديدة في المناطق المناسبة من جهاز Q picks. اطلب من الروبوت ملء حمامات التنظيف بالكواشف المناسبة.

ضع 2% micro 90 في الحوض الخلفي، والماء المقطر المعقم بجهاز الأوتوكلاف في الحوض الأوسط، و80% ethanol في الحوض الأمامي. باستخدام برنامج التكرار الخاص بجهاز qix two، اختر الرأس المناسب بالإضافة إلى عدد وأنواع كل من أطباق المصدر وأطباق الوجهة. قم أيضاً بضبط الرأس ليتم تنظيفه بين عمليات التكرار.

عادة ما تكون ست دورات في كل حمام كافية. تبلغ سعة الجهاز 10 أطباق في المرة الواحدة. اضبط الجهاز لبدء التشغيل.

ستستغرق عملية النسخ حوالي 15 دقيقة. سعة كاملة باستخدام رأس مكون من 384 دبوساً. بمجرد نسخ الأطباق، يتم تحضينها عند 37 درجة Celsius لمدة 24 ساعة في صندوق رطوبة.

تعد فترة الحضانة الطويلة ضرورية نظراً إلى تحفيز إنتاج عدد نسخ مرتفع من smid بإضافة arabinose. وفي هذه الأثناء، قم بتنظيف روبوت Q fill three كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد انتهاء الحضانة، أخرج الأطباق من الحاضنة عند 37 °C.

ضع الأغطية جانباً وضع الأطباق على منصة تحميل المخزن المرفقة بجهاز التكديس السريع. تأكد من تتبع ترتيب الأطباق لأن البرنامج لا يقوم بذلك. سيتم قراءة الأطباق الموجودة في أسفل المكدس.

أولاً، قم بإزالة مخزن واحد من المكدس السريع. تأكد من أنه فارغ ثم ادفعه فوق مكدس الأطباق المراد قراءتها. أمسك المخزن من المقبض وسينزلق الطبق ليتحمل داخل المخزن.

قم بتحميل المخزن في المكدس السريع بالاتجاه الصحيح. افتح برنامج المسح الضوئي على الكمبيوتر المتصل. اختر "جلسة جديدة" وقم بتسميتها بشكل مناسب.

اختر طبق 384 بئراً بقاع مسطح ليكون هو الطبق المستخدم. أدخل البيانات في منطقة تخطيط الطبق. حدد زر المعالج واختر إضافة 384 عينة مجهولة إلى الطبق.

في منطقة البروتوكول، اختر خيار حلقة الآبار (well loop) وأدخل 384 بئراً. ستظهر أيقونة حلقة الآبار في شجرة التدفق على الجانب الأيسر من الشاشة. حدد الأيقونة وانقر لإضافة قياس فوتومتري.

اضبط الجهاز للقراءة عند 600 nanometers. احفظ البروتوكول باسم فريد ثم أغلق برنامج المسح الضوئي. بعد ذلك، افتح برنامج polara RS.

توجد في الصفحة الرئيسية قائمة بالأجهزة المتصلة بجهاز rapid stack، وتحت عنوان VARI scan، انقر فوق خيار run session. ستظهر بعد ذلك نافذة المقايسة وبها مخطط انسيابي في المنتصف. اختر عنصر run session، ثم ابحث عن اسم المسح المحفوظ.

يتم إعادة التشغيل من القائمة المنسدلة التي تظهر على الجانب الأيمن من الشاشة. بمجرد اختيار البروتوكول، انقر فوق "تشغيل". سيظهر مربع حوار لهذا المقايسة يسأل عن المجلة التي سيتم استخدامها كمصدر والمجلة الفارغة.

يتوافق المربع السفلي على الشاشة مع مخزن العينات الأمامي. تأكد من تشغيل كل من rapid stack و Vario scan ثم انقر فوق "بدء". سيقوم rapid stack بتحميل الأطباق تلقائياً في قارئ الأطباق، مما يسمح بإجراء قياسات مستمرة للأطباق.

راقب تحميل اللوحة الأولى في جهاز Vario scan للتأكد من المحاذاة الصحيحة للآلات من أجل القراءة. تستغرق قراءة 25 لوحة حوالي 50 دقيقة. بمجرد انتهاء مسح Barrios، قم بإزالة المخزن الممتلئ ووضعه على منصة تحميل المخزن.

ارفع المستطيل الخارجي للمنصة وسينزلق المخزن، مما يترك الأطباق قائمة في كومة في المنتصف. وأخيرًا، أعد وضع الأغطية على الأطباق لإجراء فحص قائم على المحلول. لبدء قياس نشاط السليلوز، قم بتحضير خليط المقايسة باستخدام مخزون جاهز من محلول التحلل بتركيز 10 أضعاف.

امزج 50 millimolar من منظم خلات البوتاسيوم عند pH 5.5 كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ثم قم بتحضير محلول مخزون بتركيز يصل إلى 75 milligrams per milliliter من ركيزة DIPHENYL أو DNP الخلوية المبيدة للحيوانات الدقيقة المولدة للون في DMSO، مع التأكد من ذوبان الركيزة تماماً. أضف المحلول المخزون من مبيد الخلايا DNP إلى خليط المقايسة ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.1 milligrams per milliliter.

ضع في اعتبارك أن كل لوحة تستهلك ٢٠ milliliters تقريباً من المحلول، ومن الضروري توفير 50 milliliters إضافية لتعويض الحجم الميت. قم بإعداد Q fill three كما سبق لإضافة مزيج المقايسة إلى كل لوحة باستخدام Q fill three. يستغرق ملء كل لوحة ٢٠ ثانية تقريباً.

بمجرد إضافة خليط المقايسة، تُحضن الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح بين 12 إلى 16 ساعة. وفي صندوق رطوبة، تُخرج الأطباق من الحاضنة عند 37 درجة مئوية. تُنحى الأغطية جانباً، وتوضع الأطباق على منصة تحميل المخزن الملحقة بجهاز الـ rapid stack بنفس الطريقة السابقة.

افتح برنامج ممسح الضوئي (scan its re) وقم بإعداده كما تم القيام به مسبقاً، باستثناء القياس الفوتومتري، الذي يجب ضبطه للقراءة عند 400 nanometers. ثم أدخل المعلمات في برنامج POLARA RS، كما تم توضيحه سابقاً.

اترك جهاز Vario scan يقوم بقراءة الأطباق. بعد انتهاء التشغيل، قم بإزالة الأطباق والتخلص منها. لتصدير قراءات الامتصاصية، افتح برنامج scan it re واختر.

افتح ملفًا موجودًا. اختر الدليل الذي تم حفظ الجلسة فيه ثم انقر على أيقونة الزائد لتوسيع القائمة. ستظهر تحت عنوان العنوان خيارات مسمى من container one إلى container N. وبناءً على عدد الأطباق، اختر الطبق الأول المراد تحليله من شريط القائمة في أعلى الصفحة، ثم اختر data report export.

اختر خيارات التصدير مثل تخطيط اللوحة والبيانات الفوتومترية. انقر فوق "عرض التقرير"، ثم "حفظ الملف". اختر المجلد المطلوب.

تنسيق المخرجات هو ورقة عمل Microsoft Excel. تظهر هنا قراءات الامتصاصية من لوحة واحدة ذات 384 بئراً تحتوي على مستنسخ إيجابي كما هو موضح، حيث تُظهر المستنسخات الإيجابية زيادة ملحوظة في الامتصاصية مقارنة بالمستنسخات التي لا تعبر عن نشاط cellulase.

يمكن أن تؤثر الاختلافات في وقت المقايسة، أو البئر، أو الموقع على الطبق، أو تركيز DNP على قراءات الامتصاص المطلقة. وتعد قراءات الامتصاص النسبية، مثل الفرق في الامتصاص فوق متوسط الطبق أو متوسط العمود، طريقة أكثر قوة لتحديد المستنسخات الإيجابية للسيلولاز. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية تحديد المستنسخات الإيجابية للسيلولاز من مكتبة ميتاجينومية.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إذابة جانب خلايا DNP في DMSO وحضانة الأطباق في غرفة رطوبة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.