تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار متغيرات محددة في بروتين BRCA1 باستخدام مقايسة إعادة التركيب المتماثل في المختبر. يتم تحقيق ذلك من خلال استبدال بروتين BRCA1 البري الداخلي بالمتغير المراد اختباره عبر عفن (transfection) كل من الحمض الريبوزي النووي المتداخل القصير (siRNA) الخاص بـ BRCA1، وبلازميد لإعادة التعبير عن بروتينات متغير BRCA1 المختبرة في الخلايا؛ وفي خطوة ثانية، يتم إدخال siRNA والبلازميد الخاص بالتعبير عن BRCA1 الطافر، بالإضافة إلى بلازميد للتعبير عن بروتين ICN1، الذي يسبب تلفاً في الحمض النووي (DNA) عند موقع محدد في جينوم DNA للخلية المختبرة. بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا لمدة يومين إلى ثلاثة أيام للسماح بحدوث تلف DNA وإصلاحه، ثم يتم الحصول على نتائج توضح ما إذا كانت متغيرات بروتينية محددة من بروتين BRCA1 تعمل في إصلاح DNA عن طريق إعادة التركيب المتماثل، وذلك بناءً على تحليل قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) للخلايا التي تعبر عن GFP.

تجمع هذه التقنية بين طريقتين راسختين من أجل إنشاء نظام متعدد الاستخدامات لتحليل متغيرات بروتينية محددة في عملية إصلاح تلف DNA عن طريق إعادة التركيب المتماثل. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن الطرق التي تم تأسيسها سابقاً كانت تعتمد على خطوط خلوية بها تعطيل جيني لبروتين BRCA1. ونحن نستخدم خطاً خلوياً أكثر سهولة في التعامل مشتقاً من خلايا HELOC، مما يسمح باستنفاد BRCA1 عن طريق تداخل RNA للبروتين الداخلي وإعادة إضافة البروتين المختبر في هذه الخلايا.

بعد التعبير عن بروتين BRC1 متغير، يمكننا الآن اختبار إعادة التركيب المتماثل. وبشكل عام، يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبات بسبب الموت الخلوي المفرط أثناء الإجراء. ومن المهم تحديد ظروف القطع بدقة لزيادة تأثير تفاعل إعادة التركيب مع الحد من السُمية الخلوية.

قبل البدء في هذا البروتوكول، تم إنشاء الخط الخلوي hela DR 13 nine عن طريق ترنسفكشن خلايا hela باستخدام P-D-R-G-F-P. يتم الحفاظ على الخط الخلوي في أطباق بتري بقطر 10 سنتيمتر في وسط يحتوي على pur mycin لاختيار الخلايا ذات الترنسفكشن المستقرة. تحتوي مادة الركيزة لإعادة التركيب في بلازميد P-D-R-G-F-P وفي المحولات المستقرة على أليلين غير نشطين من GFP. أحد الأليلين غير نشط بسبب إدراج موقع تعرف لإنزيم التقييد بطول 18 زوجاً قاعدياً لـ ISCE one.

في تسلسله التشفيري، يؤدي التعبير عن ISCE one في هذه الخلايا إلى إحداث كسر مزدوج الشريط في الحمض النووي (DSB) في الأليل الثاني من GFP غير النشط. ويعد جزء تسلسله المرتبط بموقع I SCE E one في الأليل الأول من النوع البري. ويمكن لهذا الأليل الثاني من GFP أن يعمل كمانح للتسلسل لإصلاح الـ DSP عن طريق إعادة الاتحاد المتماثل، مما يؤدي إلى تكوين أليل GFP نشط، والذي يمكن اكتشافه بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي في اليوم السابق لعملية عفن الخلية الأولى.

احصل على طبق بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على خلايا hela DR 13 nine التي وصلت نسبة التقائها إلى 90% على الأقل، ثم قم بمعاملة الخلايا بإنزيم التربسين في 1 ملليلتر لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق. أوقف التفاعل بإضافة 9 ملليلتر من D-M-E-M-F-B-S واخلط معلق الخلايا جيداً باستخدام الماصة. أضف 40 ميكرولتر من الخلايا المعالجة بالتربسين لكل بئر من أطباق ذات 24 بئراً في 0.5 ملليلتر من D-M-E-M-F-B-S، ثم قم بتحضين الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل.

في اليوم الأول، يجب أن تتراوح درجة تلاقي الخلايا بين 40 و50%. ابدأ عملية التعداء الوراثي عن طريق خلط كل من الـ irna لاستنفاد b RCA one الداخلي وبلازميد تعبير B RCA one الطافر في وسط optimum. بعد ذلك، ادمج الأحماض النووية مع lip في وسط optimum.

باشر بعملية ترانسفكشن الليبكتومي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة بعد عملية الترانسفكشن. أعد الخلايا إلى الحاضنة. استبدل الوسط بعد أربع إلى ست ساعات بوسط لا يحتوي على مضادات حيوية.

أعد الخلايا للتحضين طوال الليل في اليوم الثاني. يتم تحلل الخلايا بإضافة 0.3 milliliters من كاشف trip le trypsin إلى كل بئر، وبعد تحضين قصير عند 37 °C، يتم تحرير الخلايا عن طريق سحب الخلايا ورفعها بواسطة الماصة في كاشف trypsin. وبمجرد إتمام عملية trypsin، يتم نقل الخلايا من طبق الـ 24 بئراً إلى طبق ستة آبار يحتوي على 2 milliliters من D-M-E-M-F-B-S لإيقاف نشاط tripsin.

اترك صفيحة الستة آبار لتتحضن طوال الليل تحت نفس الظروف السابقة، وذلك قبل يومين من عملية التعدي الأولي. قم بتحضير SIR A، والحمض النووي البلازميدي المعبر عن طفرة BRCA one، والبلازميد المعبر عن ISCE في 62.5 µL من Optum. اخلط هذا المحلول مع 2.5 µL من LIPECTOMY 2060 و2.5 µL من Optum.

باشر بعملية عفن الخلايا (transfection) بعد حضانة تتراوح من أربع إلى ست ساعات. استبدل الوسط الغذائي بوسط D-M-E-M-F-P-S الخالي من المضادات الحيوية. أعد الخلايا إلى الحاضنة في اليوم السادس.

قم بهضم الخلايا في كل بئر عن طريق إضافة 0.5 milliliters من كاشف trypsin. أوقف التفاعل بإضافة two milliliters من D-M-E-M-F-B-S، ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة five minutes في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في one milliliter من D-M-E-M-F-B-S الطازج، وحلل 10,000 خلية لكل بئر للكشف عن تعبير GFP.

عن طريق قياس التدفق الخلوي، يتم تحديد الخلايا الحية المفردة باستخدام معايير التشتت الأمامي ومعايير الحجم. يتم توجيه الخلايا الموجبة لـ GFP باستخدام كاشف فلورة GFP، وتُعرض النتائج على شكل مخطط تكراري. ويمكن إعادة استزراع الخلايا المتبقية من أجل التصوير بالفلورة.

يُظهر الفحص المجهري أن بروتين BRCA1 ينظم مسار إصلاح كسور الحمض النووي DNA مزدوجة السلسلة عن طريق إعادة التركيب المتماثل. ويمكن الكشف بسهولة عن الخلايا التي خضعت للإصلاح بواسطة إعادة التركيب المتماثل باستخدام المجهر الفلوري. ويؤدي استنفاد BRCA1 بواسطة تقنية RNAi إلى انخفاض حاد في عدد الخلايا الموجبة لـ GFP التي يتم الكشف عنها.

تتمثل مخرجات تحليل التدفق الخلوي (FCA) في مدرج تكراري يوضح شدة GFP لكل خلية على المحور السيني (x) وعدد الخلايا على المحور الصادي (Y). في غياب عملية ترانسفكشن لـ I SCE واحدة تعبر عن البلازميد، لا يتم رصد أي خلايا موجبة لـ GFP.

تم الحصول على النتائج في الأعمدة من الثاني إلى السادس جميعها من خلايا تم نقل بلازميد تعبير ISC one إليها في اليوم الثالث. وفي مجموعة نموذجية من نتائج تجربة واحدة، تكون نسبة الخلايا الموجبة لـ GFP هي 15.5% بعد تعبير I SCE one واستنفاد RNAi الضابط لجين غير ذي صلة؛ وبالمقارنة، أدى استنفاد BRCA one وإضافة ناقل بلازميد فارغ إلى خفض تحول GFP إلى 0.7%. وقد أدت إضافة BRCA one من النوع البري خارجي المنشأ إلى استعادة إعادة التركيب المتماثل بشكل كامل، كما تم الكشف عن ذلك من خلال الحصول على خلايا موجبة لـ GFP بنسبة تتراوح بين 15 إلى 16%.

وبالمثل، فإن التعبير عن متغير آخر غير معروف الأهمية. لقد استعاد طفرة BRCA1 21B وظيفة إعادة التركيب المتماثل المعتمدة على BRCA1 بشكل كامل، بينما أدىت إضافة الطفرة BRCA1 M18T إلى تأثير مشابه للناقل الضابط.

بما أن هذا المتغير تم التعبير عنه بمستويات مماثلة للبروتين الداخلي، فإن ذلك يشير إلى أن المتغير BRCA one M 18 T غير فعال في عملية إعادة الاندماج المتماثل. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة نمو الخلايا، حيث تنمو الخلايا ببطء وبكثافة منخفضة، لذا يجب تقليل كمية خليط عفن الخلايا (transfection mixture) المستخدمة. كما أنه من المهم إزالة وسط عفن الخلايا في الوقت المناسب.

لقد وجدنا في الأيام التي تلت عملية ترنسفكشن (transfection) وجود درجة عالية من السُمِّيَّة الخلوية عند إضافة المضادات الحيوية إلى الوسط. ولهذا السبب، خلت جميع الأوساط المستخدمة بعد اليوم الأول من المضادات الحيوية بعد تحضيرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث سرطان الثدي لاستكشاف الوراژيات الخاصة بمتغيرات BRC1 ذات الدلالة السريرية غير المعروفة في عيادات السرطان.

نأمل أن يساهم اختبار BRC one الوظيفي الذي تم تطويره في هذا العمل في تحسين التنبؤ بآثار متغيرات BRC one على القابلية للإصابة بالسرطان.