بمساعدة الحاسوب على نطاق واسع التصور النوعي والكمي لقداس جزيرة البنكرياس والتوزيع الحجم والعمارة

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع بيانات ممثلة وغير متحيزة ضمن عينة محدودة، وتحليل البنية ثلاثية الأبعاد المعقدة للنسيج بدقة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التقاط شرائح افتراضية لمقاطع بنكرياسية مصبوغة كيميائياً نسيجياً مناعياً. بعد ذلك، يتم قياس الشرائح الافتراضية كمياً باستخدام ماكرو الشريحة الافتراضية لـ IHC في برنامج image J، ثم تُحلل البيانات باستخدام برمجيات مكتوبة لبرنامج Mathematica.

بعد ذلك، يتم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للشرائح الافتراضية باستخدام برنامج Image J. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في التقاط مجموعة من صور الجزر الفردية باستخدام برنامج slide book ورسم خرائط لمجموعات الصور يدويًا في ثلاثة أبعاد باستخدام برنامج stereo investigator. وفي النهاية، يمكن الحصول على بنية دقيقة للجزر مع إحداثيات ثلاثية الأبعاد لكل خلية من خلايا الجزر من خلال طريقة مدمجة من التصوير ثلاثي الأبعاد ورسم الخرائط اليدوي. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال دراسات السمنة والسكري، مثل كيفية تأثير الظروف الفسيولوجية والباثوفسيولوجية على كتلة خلايا بيتا البنكرياسية، وتوزيع الجزر وبنيتها.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو تشخيص أو علاج السمنة وداء السكري (diabetes Melitis)، حيث إن الفهم الأفضل للتغيرات في كتلة خلايا بيتا سيسهل تطوير التدخلات العلاجية وتقييمها. وبالرغم من أن الطرق الموضحة في الدراسة الحالية توفر رؤية متخصصة في التحليل الكيميائي النسيجي المناعي الديناميكي للبنكرياس، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على مجموعة من الكائنات الحية والأنسجة الأخرى. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم خطوات التحليل بمساعدة الحاسوب.

بسبب تعقيد تحليل مثل هذه المجموعات الكبيرة من البيانات في بُعدين وثلاثة أبعاد. ابدأ هذا الإجراء بوضع شريحة نظيفة تحتوي على مقطع كامل من بنكرياس مصبوغ كيميائياً مناعياً في حامل المجهر الفلوري. افتح برنامج Stereo Investigator وعاين العينة بالنقر على acquisition.

ثم ابدأ التصوير الحي. حدد مستويات التعريض لكل قناة باستخدام نافذة المدرج التكراري للفيديو، والتي تعرض شدة الفلورة. في هذا المثال، تُستخدم القناة الثانية لـ DAP، والقناة الثالثة لـ GFP، والقناة الرابعة لـ RFP، والقناة الخامسة لـ sci five، والقناة السادسة لـ SCI seven.

باستخدام نافذة إعدادات الكاميرا، اضبط مستوى التعريض الضوئي بحيث تتلاشى شدة الفلورة. ويمكن تركيز الصورة باستخدام عجلة تركيز المجهر عند الطرف الأيمن من المدرج التكراري للفيديو. وقبل إنشاء مقطع افتراضي، قم بتحديد محيط العينة من خلال النقر على الشاشة في نقطة بعيدة عن العينة، وهو ما سيحدد نقطة مرجعية.

بعد ذلك، انقر حول مخطط العينة عند اكتمال تحديد المحيط. انقر بزر الماوس الأيمن واختر "close contour" لربط نقطتي البداية والنهاية بمجرد إغلاق المحيط، ثم التقط شريحة افتراضية للعينة عن طريق اختيار "acquisition"، ثم "acquire virtual slice". وعندما تفتح خيارات نافذة الشريحة الافتراضية، اختر "high speed acquire"، مع تعطيل خيار "manual".

يتم التركيز من خلال إلغاء تحديد المربع الموجود بجانب manual. احفظ الملف. قم بمعايرة الـ prefo من خلال النقر بزر الماوس الأيمن واختيار add to focus site list.

قم بضبط التركيز يدويًا لعدة مقاطع عشوائية في معاينة الشريحة الافتراضية. وعندما يتم ضبط التركيز في عدة مواقع، ابدأ الشريحة الافتراضية عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن والاختيار. ابدأ الشريحة الافتراضية مع الضبط المسبق للتركيز (prefo)، وبعد اكتمال الشريحة الافتراضية للعينة الأولى، انتقل إلى القناة التالية واضبط التعريض الضوئي وفقًا لذلك. تكرر هذه العملية لكل قناة لإجراء التكميم للعيينات (eyelets)، ثم تُعالج الصور باستخدام ماكرو ImageJ باسم I-H-C-V-S، والذي يقوم أولاً بتجهيز الصور المحملة للتحليل ثم تكميم سمات العيينات (eyelets) مثل التركيب الخلوي.

تقوم وحدات الماكرو I-H-C-V-S بتقسيم المكدس إلى قنوات الألوان الخاصة به. وفي برنامج Image J، يتم تحويل كل صورة إلى قناع أبيض وأسود بـ 8 بت. وبعد تحديد عتبة الشدة تلقائيًا، يتم جمع صور القنوات المنفصلة حسابيًا في قناع مركب.

بعد ذلك، سيقوم تحليل الجسيمات المدمج في برنامج Image J على الصورة المركبة بتحديد المناطق ذات الأهمية (ROIs) مع استبعاد الجسيمات الأصغر من خلية بيتا واحدة. وينتج عن قياس هذه المناطق (ROIs) باستخدام برنامج Image J جدول بيانات يتضمن معايير الخلايا.

احفظ النتائج المجمعة في جدول بيانات Excel. قم بتخزين بيانات مثل محيط المساحة، والدائرية، وقطر Fer، ومركز الفتحة لكل فتحة، جنباً إلى جنب مع الأرقام المقابلة المحددة في الصورة. يمكن إجراء التحليل الحسابي لهذه المعايير كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. وللكشف عن معلومات تشمل توزيع الفتحات وتحليل التكرار، قم بإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للشرائح الافتراضية عن طريق تشغيل نص برمجي (script) يحول جميع صور JP two في الدليل إلى ملفات TIF، وهي الصيغة المستخدمة في بناء وقياس المجموعات ثلاثية الأبعاد من الشرائح الافتراضية.

هنا، يتم استخدام نص برمجي يسمى I MJ two two tiff. انسخ النص البرمجي إلى الدليل الذي يحتوي على صور JP two. قم بتشغيل النص البرمجي باستخدام غلاف Linux عن طريق كتابة dot slash I am JP two two TIFF في وحدة التحكم ثم الضغط على enter.

عند تحويل جميع الصور الملتقطة من ملفات JP2 إلى ملفات TIFF، تصبح جاهزة للاستخدام في التحليل بواسطة برنامج Image J. باستخدام Image J، افتح جميع الصور الخاصة بالعينة الأولى، والتي تكون في هذه الحالة من بنكرياس جنين بشري، وادمجها في صورة واحدة عن طريق اختيار Image ثم Color ثم Merge Channels. كرر هذه العملية لكل عينة من العينات، وبمجرد دمج جميع العينات في صور فردية، قم بتنظيف الصور عن طريق تحديد المناطق غير المرغوب فيها باستخدام أداة Polygon Selections.

املأها عن طريق اختيار تحرير (edit)، ثم تعبئة (fill). قم بتحويل كل صورة إلى صورة ملونة بنظام RGB. وأخيراً، أنشئ مصفوفة (stack) من الصور، والتي يمكن بعد ذلك محاذاتها بشكل أدق باستخدام ملحق stack reg.

وفي النهاية، يؤدي دمج القنوات وتركيب الصور إلى إنشاء مونتاج ثلاثي الأبعاد لجميع العيينات في البنكرياس بأكمله. ولجمع مجموعات الصور المتراكمة، ضع عينات العيينات البنكرياسية المثبتة بالكامل تحت المجهر. وضع الماء في حال استخدام عدسة شيئية ذات غمر مائي.

افتح برنامج slide book، وانتقل إلى التحكم في الالتقاط والتركيز بالضغط على control plus shift plus E في نافذة التحكم في التركيز. اضبط العدسة الشيئية على 20 times أو 40 times بناءً على حجم العروة. لاستخدام عدسة المجهر العينية لتحديد موقع العروات، اضبط bin على two times واضبط مجموعة المرشحات على user one.

في نافذة التحكم في التركيز، يجب ضبط اختيار الانبعاث على 100%، وضبط الكثافة الحيادية على نقرة واحدة GFP ey، ثم فتح الأرضية لمعاينة العينة في slide book، والعودة إلى نافذة التحكم في التركيز وتحويل مجموعة المرشحات إلى fix. بعد ذلك، انقر على G-F-P-D-S. استخدم عصا التحكم لتوسيط العروة في نافذة الكاميرا one قدر الإمكان.

قم بضبط التركيز على عمق قريب من مركز العروة حيث يمكن تمييز الخلايا بسهولة. في نافذة التحكم في التركيز، اختر zab. استخدم عنصر التحكم في المجهر للتمرير إلى أقصى عمق للعروة يمكن فيه تمييز المعالم بوضوح، ثم انقر على set top.

قم بالتمرير إلى أسفل العروة وانقر على تعيين. انقر على أسفل ثم انتقل. للعودة إلى نقطة المرجع في نافذة الالتقاط، انقر على خيارات متقدمة، ثم على الوضع البديل للقناة.

اضبط عامل التجميع (bin factor) على مرتين ونوع الالتقاط على 3D في الجانب الأيمن من النافذة، ثم انقر فوق استخدام الموضعين العلوي والسفلي والعودة إلى الحجم المركزي بعد الالتقاط. اضبط حجم الخطوة على ثلاثة. اضبط مجموعة المرشحات على الوضع المباشر (live) أسفل مربع مجموعة المرشحات.

حدد DAP و E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U و SCI five DSU. لكل منها، انقر فوق "find best" ضمن "adjust exposure". ثم انقر فوق "test" للتأكد من أن التعريض المختار مناسب.

انقر فوق "بدء" (start) لبدء عملية الالتقاط. عند اكتمال الالتقاط، اضبط المستويات حسب الضرورة وقم بتغيير اللون المعروض لـ RFP إلى اللون الأبيض. احفظ الشريحة ثم انتقل إلى عرض سلسلة صور TIFF المصدرة (export TIFF series).

اكتب اسم الشريحة مع وضع شرطة في نهايتها ثم قم بحفظها. سيتم إنشاء العشرات من ملفات TIF الفردية، لذا قد يكون من المفيد الاحتفاظ بمجموعة صور كل فتحة عين في مجلد منفصل. ولرسم خرائط مجموعات الصور، افتح برنامج stereo investigator.

قم بتصور الصورة عن طريق فتح مجموعات الصور في قائمة تحجيم الصور. اضبط المسافة بين الصور على 3 microns لتصحيح انحناء بمقدار مرتين. في دفتر الشرائح، اختر تجاوز تحجيم X و Y واستخدم قيمة محددة لمصدر تحجيم x و Y.

أدخل 0.65 لكل من المركز X وY، وقم بتكبير الصورة من خلال النقر على زر التكبير، ثم قم بتحديد خلية واحدة على الأقل في منتصف الجزيرة المستهدفة في نافذة العرض الكلي (macro window). وباستخدام العلامة المناسبة، ستظهر خلايا beta باللون الأخضر، بينما ستظهر خلايا alpha باللون الأحمر، وستظهر خلايا delta باللون الأبيض.

حدد الخلايا في مركز نواتها، والتي ستظهر باللون الأزرق إذا تم صبغ العينة باستخدام DPI؛ استخدم العلامة الثانية (Marker two) لتمييز خلايا بيتا، والعلامة الخامسة (Marker five) لتمييز خلايا ألفا، والعلامة السادسة (Marker six) لتمييز خلايا دلتا. بمجرد تحديد خلية واحدة على الأقل، اعرض المنظر المتعامد (orthogonal view) باستخدام الأيقونة الموجودة في القائمة العلوية، ثم قم بتفعيل خياري مرشح Z (Z filter) والتناظر (symmetric).

يجب ضبط النطاق على 15.00. ابدأ من النقطة 0.0 Z. قم بالتمرير عبر الفتحات باستخدام عجلة الماوس وحدد كل خلية بالعلامة المناسبة؛ حدد كل خلية مرة واحدة فقط عند مركز عمقها. عند الانتهاء من تحديد كل مستويات Z، يمكن إلغاء تحديد مربع اختيار مرشح Z.

سيعرض هذا جميع العلامات من كافة مستويات Z. وعندما يتم تحديد كل خلية، احفظ الملف بصيغة DAT. ثم انتقل إلى تصدير تتبع الملف (file export tracing).

احفظ التتبع كملف TXT. وأخيرًا، انقر فوق "new data file" لمسح مساحة العمل قبل محاولة تحديد جزر البنكرياس الجديدة. يتيح تحضير المقاطع الافتراضية من عينة بنكرياس مصبوغة كيميائيًا نسيجيًا فحص الخلايا الصماء من نوع ألفا وبيتا ودلتا في البنكرياس بأكمله معًا كجزر بنكرياسية؛ حيث يظهر الصبغ الكيميائي النسيجي للإنسولين باللون الأخضر، والجلوكاغون باللون الأحمر، والسوماتوستاتين باللون الأبيض، و dap باللون الأزرق.

بعد ذلك، تم تحويل الصور إلى قناع من ثمانية بتات بعد إجراء عملية العتبة التلقائية. تظهر هنا الصورة المركبة المدمجة. ومع ذلك، فإن توزيع العيينات باستخدام الشريحة الافتراضية يتيح أيضاً التحليل الفردي في قنوات منفصلة.

تظهر هنا مناظر لكل قناة للكشف عن خلايا دلتا، وخلايا بيتا، وخلايا ألفا. أُجري تحليل الجسيمات على قناع مركب يظهر كل بنية عينية مرقمة ومميزة باللون الأزرق. يتم إخراج تحليل الجسيمات للأقنعة المركبة في شكل جدول بيانات يحتوي على معاملات مثل مساحة الجزيرة ومحيطها والاستدارة وأقطار مختلفة لكل بنية عينية تم اكتشافها، والتي تحمل معرفات تتوافق مع العلامات المرقمة في القناع المركب.

يؤدي التحليل واسع النطاق لهذه الصور إلى إنتاج مخططات توزيع تكرارية للعدد الإجمالي للجزر البنكرياسية وأحجامها، بالإضافة إلى مقارنات تفصيلية لمساحات خلايا ألفا وبيتا ودلتا. يمكن لرسم خرائط الجزر والتحليل الرياضي للتكوين والبنية الخلوية أن يكشف عن مستوى بؤري واحد من مجموعة صور مُعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد للجزر البنكرياسية البشرية التي تم رفعها إلى برنامج Stereo Investigator. هنا، تظهر خلايا بيتا باللون الأخضر، وخلايا ألفا باللون الأحمر، وخلايا دلتا باللون الأبيض، والنوى باللون الأزرق.

عقب التقاط عيينات متميزة من الجزر البنكرياسية (eyelets)، يتم تحديد خلايا ألفا وبيتا ودلتا عند مستويات بحرية مختلفة هنا، وتظهر الصور الفلورية وبيانات الخرائط المقابلة لثلاثة مستويات بؤرية مختلفة بفاصل 10 microns. وبمجرد تحديد خلايا ألفا وبيتا ودلتا في المستويات المختلفة، يمكن تصور الجزر البنكرياسية ثلاثية الأبعاد. يظهر هنا إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للجزر البنكرياسية المقطوعة ربعياً بناءً على الإحداثيات التي تم الحصول عليها من تخطيط الجزر البنكرياسية.

علاوة على ذلك، يمكن للتحليل الرياضي المؤتمت للعينات المحددة (eyelets) أن يوضح التركيب الخلوي والبنية الهيكلية. يظهر هنا التردد النسبي للمسافات بين الخلايا لخليتين ضمن مجموعة خلوية واحدة. كما يظهر أيضاً التردد النسبي للمسافات بين الخلايا لخليتين من مجموعتين خلويتين مختلفتين.

كما تظهر أيضاً الاحتمالات التراكمية لتوزيعات المسافات بين الخلايا من نوع alpha إلى alpha، ومن beta إلى beta، ومن delta إلى delta. ويمكن إجراء اختبار كولموغوروف-سميرنوف (KS) على هذه الاحتمالات للحصول على مسافات KS المقابلة. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إجراء التصوير والتحليل واسع النطاق لمقطع نسيجي كامل في غضون أربع ساعات.

يمكن إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لكتلة من النسيج في غضون 30 دقيقة. وأخيراً، يمكن إتمام التصوير ثلاثي الأبعاد ورسم الخرائط اليدوي في غضون أربع ساعات إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم البدء بتلوين كيميائي نسيجي مناعي عالي الجودة للمقاطع.

ستعتمد دقة التحليل اللاحق كلياً على البيانات الخام. تأكد أيضاً من أن أجهزة الكمبيوتر الخاصة بك تحتوي على 8 gigabytes على الأقل من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) لمعالجة هذا التحليل واسع النطاق بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين، ليس فقط في مجال السمنة والسكري، بل على نطاق واسع في العديد من المجالات الأخرى التي تستخدم التحليل الباثولوجي القياسي.

قد يكون هذا الأمر مفيدًا بشكل خاص عندما تكون العينات المتاحة محدودة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع بيانات تمثيلية غير منحازة ضمن حجم عينة محدود باستخدام التقنيات القياسية. إن اختيار منطقة محددة فقط قد لا يكون ممثلاً للصورة الكاملة، كما أوضحنا من خلال دراستنا لتوزيع جزر البنكرياس.