بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مكتبة طفرات عشوائية لتسلسل DNA مستهدف محدد، وتحديد وتوصيف الطفرات بسرعة باستخدام الانتقاء الوظيفي شبه الكمي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحويل بلازميد ذو أصل تضاعف واحد يحتوي على التسلسل المستهدف إلى سلالة مُحدثة للطفرات من بكتيريا E. coli. بعد توزيع الخلايا على أطباق الزرع وتحضينها طوال الليل، يتم حصادها وعزل البلازميد المستهدف للحصول على مكتبة الطفرات، ثم يتم تحويل مكتبة الطفرات هذه إلى سلالة قراءة لتوصيف الطفرات في الجزء الثاني من البروتوكول؛ حيث يتم إنشاء طبق نمو متدرج وتحميل مستنبتات بكتيرية من سلالة القراءة في طبق بتري منفصل يحتوي على آغار لين.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في نقل هذه المزارع البكتيرية بالختم إلى التدرج. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تغيرات في ملف النمط الظاهري لتسلسل مستهدف معين من خلال الاختلافات في النمو على تدرج دوائي. يقدم هذا الفيديو طريقة للتطور الموجه للبروتينات في e coli.

تحاكي هذه العملية التطور الطبيعي في إنشاء مكتبات مغذيات عشوائية، يتبعها عملية اختيار تفرض قيوداً على هذا التنوع. وبذلك، فإنها تعزز قدرتنا على توليد أنشطة كيميائية حيوية جديدة للأغراض الصناعية أو الطبية الحيوية. تتكون هذه الإجراءات من جزأين: إنشاء مكتبة طفرات عشوائية، والاختيار الوظيفي للحصول على طفرات تؤدي إلى اكتساب الوظيفة. ستقوم جينيفر ألين، وهي فنية من مختبري، باستعراض هذا الإجراء.

قبل البدء في هذا البروتوكول، يتم استخدام خلايا JS 200 ذات كفاءة كهربائية تعبر عن متغير منخفض الدقة من إنزيم DNA polymerase one أو low fidelity pole 1، والتي تم تحضيرها مسبقاً كما هو موضح في البروتوكول المكتوب؛ تحتوي هذه الخلايا على أليل حساس للحرارة من pole 1، بحيث يسود نشاط low fidelity pole 1 عند درجة حرارة 37 °C. يتم بناء بلازميد مستهدف يحتوي على أصل تضاعف coli 1 مع استنساخ التسلسل المستهدف بجوار أصل التضاعف، حيث يقوم low fidelity pole 1 ببدء تضاعف بلازميد coli 1، مما يؤدي إلى إدخال طفرات لبدء عملية التطفير.

امزج 40 µL من الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية وما بين 30 إلى 250 ng من DNA البلازما المستهدف في فجوة تبلغ 2 mm. قم بإجراء نبضة التثقيب الكهربائي للخليط في جهاز التثقيب الكهربائي عند 1800 V. تحقق من الثابت الزمني أو TC لضمان ظروف تثقيب موحدة لكل عينة.

يفضل أن يكون TC مساوياً لخمس إلى ست مللي ثانية. اترك مزيج الحمض النووي للخلية ليتعافى في 1 مللي لتر من مرق LB لمدة 40 دقيقة عند 37 °C مع الرج بسرعة 250 RPM. أحضر طبق بتري LV agro مقاس 100 ملم تم تسخينه مسبقاً إلى 37 درجة مئوية ويحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لاختيار كلا البلازميدات، ثم ازرع الخلايا المتعافية بتخفيف مناسب للحصول على تركيز قريب من نمو السجادة (lawn concentration)، والذي يُعرَّف بأنه عدد متميز ولكن لا يمكن عده من المستعمرات كما هو موضح في هذا المثال.

بعد التحضين طوال الليل، يتم حصاد المستعمرات البكتيرية من أطباق بتري باستخدام مرق LB. يتم عزل البلازميد DNA من الخلايا المحصودة، ويشكل البلازميد DNA الناتج مكتبة الطفرات العشوائية.

قم بإجراء هضم تقييدي عن طريق قطع مكتبة البلازميد باستخدام إنزيم تقييد يعمل على خطيّة كل من البلازميد المستهدف والبلازميد القطبي. قم بتشغيل هلام تحليل aro على حمض DNA البلازميدي المعزول للتأكد من الجودة والكمية. بمجرد التحقق من البلازميدات، قم بهضم ميكروغرام واحد من المكتبة باستخدام إنزيم تقييد يعمل على خطيّة البلازميد القطبي، ولكن لا يقطع البلازميد المستهدف.

بعد اكتمال عملية الهضم التقييدي، قم بتنقية المكتبة باستخدام طقم تنقية DNA. وأخيراً، قم بتحويل المكتبة المنقاة إلى سلالة قراءة لتوصيف الطفرات. لبدء تحضير التدرج، حدد 10 ممرات موزعة بالتساوي عبر إحدى حواف الجزء السفلي من طبق بتري المربع.

ضع الطبق على سطح مائل بحيث يكون الحافة السفلية المحددة مرفوعة بمقدار 7 mm. صب 25 mL من وسط lb agar الدافئ والممزوج جيداً بتركيز مناسب من عامل الانتخاب في الطبق المائل. تمثل هذه الطبقة القاعدة السفلية للتدرج.

تأكد من توزيع أغار LB في طبق بتري بحيث يحتوي الطرف المرتفع المميّز من الطبق على حوالي 1 مم من أغار LB، بينما يحتوي الجزء المنخفض على حوالي 8 مم. غطِّ الطبق بالغطاء KU للتهوية واترك الآجار يتصلب لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. بعد تصلب الطبقة السفلية من أغار LB، انقل الطبق إلى سطح مستوٍ.

بعد ذلك، صب 25 milliliters من وسط LB agar الدافئ بدون العامل الانتخابي لتغطية سطح الطبقة الأولى، مع التأكد من تغطية الطبقة السفلية بالكامل. غطِّ الطبق بالغطاء جزئياً للتهوية، ثم اترك الـ agar ليتماسك لمدة 10 إلى 15 دقيقة لإجراء عملية نقل البكتيريا عن طريق الختم. أولاً، احصل على مستنبتات بكتيرية من سلالة القراءة وقم بتخفيفها لتكون ذات كثافات خلوية متماثلة، بحيث تكون الكثافة الضوئية عند 600 nanometers أقل من 1.0.

بعد ذلك، انقُل 2 mL من الآجار اللين السائل المتوازن عند 42 °C إلى قاع طبق بتري دائري بقطر 100 mm، ثم استخدم الماصة لإضافة 40 µL من المزرعة البكتيرية إلى الآجار اللين، وبعد ذلك اخلطه عن طريق هز الطبق. غطِّ الحافة الطويلة لشريحة المجهر الزجاجية بمزيج الآجار اللين. ثم قم بمحاذاة الحافة المطلية للشريحة مع العلامة السفلية الموجودة على طبق التدرج.

لامس الشريحة بسطح الآجار. يكفي اللمس الخفيف لنقل شريط من الآجار الرخو إلى سطح التدرج. ثم تُنحى الشريحة جانباً لتنظيفها وإعادة استخدامها.

كرر هذه العملية. يجب إدراج العينات المتبقية والضوابط التجريبية في كل طبق تدرج. في حالة تشغيل تدرجات متعددة، يتم تحضين طبق التدرج مقلوباً طوال الليل عند 37 °C، وقد تختلف أوقات ودرجات حرارة التحضين باختلاف السلالات البكتيرية المستخدمة في القراءة، ولكن التحضين طوال الليل عند 37 °C يكون كافياً عادةً لظهور نمو مرئي.

أخيرًا، قم بتصوير وتحليل نمو الخلايا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. تظهر هنا صور لسلالة قراءة تم تحويلها إما بـ P-G-F-U-V غير مطفر أو بمكتبة طفرات PG FPUV التي خضعت لأربع جولات من التطفير؛ حيث تشير المستعمرات المظلمة أو الباهتة إلى بلازميدات تحتوي على طفرات تسبب تعطيل GFP.

يمثل هذا الشكل تكرار الطفرات على طول التسلسل المحايد للبلازميد المستهدف بفواصل زمنية قدرها 100 base pair. لاحظ أن الطفرات تحدث عبر تسلسل البلازميد بأكمله، ولكن بأعلى تكرار بالقرب من أصل التضاعف. وهنا، يتم عرض نمو الطفرات مقابل تدرج دوائي.

تشير المسافة التي تم نموها باتجاه أعلى التدرج إلى اختلاف ملف مقاومة العقار بين الطفرات. في هذا المثال، تم فحص مكتبات بلازميدية من إنزيم نزع الميثيل التأكسدي البشري ABH two للبحث عن طفرات ذات مقاومة متزايدة لـ methyl methane sulfonate باستخدام تدرجات اختيار العقار. تظهر هذه المكتبات، والتي تمثل دورتين وأربع دورات من بروتوكول إحداث الطفرات، في مقارنة مع النوع البري الأبوي والمتجه الفارغ.

يشير الخط الأبيض إلى العتبة التي تم عندها عزل مستعمرات طافرة فردية. ولإجراء المزيد من التحليل المظهري، تم عرض الطفرات المسببة لإنزيم beta-lactamase، وهي R 1 64 H و E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R التي تم تحديدها مسبقاً باستخدام طفرات P one منخفضة الدقة واختيار astri و m، على تدرج Cefotaxime بتركيز 0.4 microgram per milliliter و 4 microgram per milliliter. وتعد الحماية ضد cefotaxime مؤشراً على نشاط beta-lactamase واسع الطيف.

لاحظ أن إنزيم بيتا-لاكتاماز من النوع البري لا يوفر أي حماية مقارنة بالخلايا التي تعبر عن ناقل فارغ. وبناءً على ذلك، تمثل هذه الطفرات تكيفاً أو تطوراً لنشاط بيوكيميائي جديد. لقد قدمنا هنا مزيجاً قوياً من التطفير والانتخاب الوظيفي من أجل توليد هذه الأنشطة البيوكيميائية الجديدة.

يمكن الحصول على اختيار وظيفي إما من خلال الاختيار الدوائي أو من خلال التكامل الجيني، وهو يستفيد من قدرتنا على توليد تنوع جيني كبير. قد يلزم تقييد التسبب المرضي بتسلسل معين من أجل تحسين أنشطة البروتين الموجودة مسبقاً أو من أجل التسبب المرضي الموجه للموقع. ويمكن القيام بهذه العمليات بسهولة عن طريق الاستنساخ.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن فصل عملية التطفير عن الاختيار الوظيفي من أجل الحصول على هجمات مميزة أو بصمات طفرية.