أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تضمين مستعمرات الخميرة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة مستعمرة مع طبقة الآجار الموجودة تحتها من طبق الآجار، ثم وضعها على عدة قطرات من الآجار المصهور وتغطيتها بسرعة بمزيد من الآجار المصهور. بعد ذلك، يتم تشذيب الآجار الزائد من المستعمرة لجعلها صغيرة بما يكفي لتناسب القالب.

يتم بعد ذلك تثبيت المستعمرة المدمجة في AER، وتلوينها، وإزالة الماء منها، وأخيرًا تغلغلها براتنج spurs. ثم تُوضع الكتلة في قالب مع كمية إضافية من راتنج spurs وتُحضن حتى تتصلب، ثم يتم تقطيعها إلى شرائح. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح توزيع أنواع الخلايا داخل مستعمرة الخميرة عن طريق المجهر الضوئي أو الإلكتروني.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر الإلكتروني الماسح في أنها تسمح بتحديد البنية الداخلية للمستعمرة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال التطور الميكروبي، مثل توزيع أنواع الخلايا داخل المستعمرات. لقد وفرت هذه الطريقة رؤية متعمقة لبنية مستعمرات croce CAC، ولكن من المرجح أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات دقيقة أخرى.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن التعامل مع المستعمرات وتضمينها قد يكون من الصعب تعلمه من خلال بروتوكول مكتوب. استُلهمت فكرة هذه الطريقة من بعض البيانات الجينية التي نشرناها في عام 2002، والتي أشارت إلى أن الأبواغ لم تكن موزعة بالتساوي في المستعمرات. وقد قمنا بتكييف طريقة لتقطيع المستعمرات كان قد طورها engelberg في مختبر fin.

لنبدأ الآن. ابدأ بحضن خميرة Wild S visi على أطباق auger عند 30 درجة حتى يتواجد ما يقرب من 300 مستعمرة. وباستخدام ملعقة مسطحة ضيقة، قم بإزالة المستعمرات التي يتراوح قطرها بين 1 إلى 2 مليمتر، واحدة تلو الأخرى من الطبق.

بعد ذلك، وباستخدام طرف ماصة سعة 1 mL، ضع عدة قطرات من الآجار بتركيز 2% عند درجة حرارة 42 °C على شريحة مجهرية، وضع المستعمرة فوراً بحيث يكون وجه الآجار للأعلى قبل أن يتصلب الآجار. ضع عدة قطرات إضافية من الآجار فوق المستعمرة واترك الآجار يتصلب، مع التأكد من أن المستعمرة بأكملها، بما في ذلك الجزء العلوي منها، محاطة بالآجار. وفي جميع خطوات البروتوكول اللاحقة، استخدم شفرة حلاقة.

قم بقص وسط AER حول المستعمرة وضع كتلة AER التي تحتوي على المستعمرة في قارورة زجاجية بوروسيليكات ذات غطاء لولبي سعة 3.5 milliliter تحتوي على مثبت مكون من 2% paraformaldehyde و 2% glutaraldehyde. يجب معالجة المستعمرات واحدة تلو الأخرى لمنع الجفاف، ولكن يمكن وضع ما يصل إلى 10 مستعمرات في نفس القارورة. تُترك المستعمرات لمدة سبعة أيام عند درجة حرارة 4 °C.

بعد مرور أسبوع واحد، قم بإزالة المثبت واغسل مستعمرات agri مرتين، باستخدام 1.5 milliliters تقريباً من sodium. Cate بتركيز 0.15 molar عند pH 7.2، ثم قم بالتحضين على الثلج لمدة 15 minutes بعد كل غسلة دون رج. كرر عملية الغسل هذه مرتين إضافيتين.

باستخدام 1.5 milliliters من محلول OS المنظم بتركيز 1X، والمكون من 100 millimolar من فوسفات أحادي البوتاسيوم و 10 millimolar من كلوريد المغنيسيوم عند pH 6.0، مع التحضين على الثلج لمدة خمس دقائق بعد كل عملية غسيل. بعد ذلك، وباستخدام نفس الأنبوب، يتم إجراء معالجة الأوزميوم وعمليات الغسيل المذكورة هنا وفي الجزء المكتوب من هذا البروتوكول. ثم مرة أخرى، وباستخدام نفس الأنبوب، يتم إجراء خطوات التجفيف المتدرجة المذكورة هنا وفي البروتوكول المكتوب المصاحب في وقت مبكر من صباح اليوم التالي.

قم بتحضير كاشف spurs كما هو موضح هنا وفي البروتوكول المكتوب المرفق. اغسل كتل agri فوراً خمس مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام 1.5 milliliters من الإيثانول بتركيز 100% في درجة حرارة الغرفة. بعد غسلة الإيثانول الأخيرة، قم بإزالة كمية كافية من الإيثانول فقط بحيث تظل كتلة agri مغطاة.

باستخدام ماصة باستور، ضع حوالي 0.5 milliliters من كاشف spurs في القارورة وقم بتدويرها على عجلة بسرعة منخفضة لمدة 15 minutes. بعد التدوير وفي درجة حرارة الغرفة، اترك القارورة لمدة 30 minutes. بعد ذلك، قم بإزالة المحلول بالكامل.

ثم أضف 1.5 milliliters من كاشف spurs لتغطية كتلة agri. مرة أخرى، قم بتدوير القارورة على عجلة لمدة 15 minutes في درجة حرارة الغرفة واتركها لمدة 30 minutes. كرر عملية الغسيل هذه.

كرر الخطوة ثلاث مرات إضافية. بعد مرور آخر 30 دقيقة، قم بإزالة كاشف spurs وأضف كاشف spurs جديداً لتغطية القوالب. اترك قوالب agri في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات.

استبدل كاشف المهماز (spurs reagent) واترك العينات في حالة دوران طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، استبدل كاشف المهماز واترك القوارير في حالة دوران حتى اليوم التالي. وفي صباح اليوم الذي يليه، ضع كاشف المهماز في قوالب سيليكون مرقمة بحيث يغطي قاع القوالب فقط.

ضع بعد ذلك كتل الآغري (agri blocks) في القوالب واحضنها عند 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. وبعد مرور أربع ساعات، أكمل ملء القوالب بمزيد من المهاميزات (spurs) والكاشف، ثم احضنها عند 60 درجة مئوية طوال الليل. أخرج الكتل من القالب من أجل التقطيع.

يظهر هنا مثال لصورة مجهرية ضوئية لمقطع عرضي عبر مركز مستعمرة من خميرة Wild S Visia. هذه الخميرة هي سلالة من النوع البري تم عزلها من إفرازات الأشجار. وقد حُضنت المستعمرة لمدة ستة أيام على وسط YNA قبل إجراء عملية التقطيع.

في هذه الصورة، يمكن التمييز بسهولة بين asai، والـ pseudo hyphy، والخميرة البيضاوية، كما تظهر بوضوح منطقة غزو المستعمرة لطبقة الآجار الأساسية. تشير الأسهم المفتوحة إلى asai نموذجية، وتشير الأسهم الممتلئة إلى خلايا خضرية بيضاوية نموذجية، بينما تشير رؤوس السهام الممتلئة إلى سلاسل من الخلايا المستطيلة و si. تعد هذه الصورة مثالاً لصورة مجهرية إلكترونية لمقطع رقيق من سلالات مختبرية من الخميرة SH 1 0 2 0، و W 3 0 3. الخلفية.

تم تحضين المستعمرة لمدة ستة أيام على وسط YNA قبل إجراء التقطيع. تُظهر الصورة منطقة من المستعمرة تحتوي على تردد عالٍ من الخلايا المتبوغة. يشير السهم إلى البنية ثنائية الطبقة لجدار البوغ.

في الجزء A، نعرض مقطعاً من مستعمرة عمرها أربعة أيام مع شبكة مكونة من 15 مستطيلاً متراكبة على الصورة في الجزء B. ويتم تمثيل تكرار الخلايا المرتبطة بالأبواغ في كل مستطيل بيانياً بواسطة 15 عموداً تقابل المستطيلات الـ 15 الموضحة في الجزء A. وتمثل البيانات المتوسط والخطأ المعياري لأربع مستعمرات مستقلة عمرها أربعة أيام. وفي الجزء C، يتم عرض المتوسطات والأخطاء المعيارية لأربع مستعمرات مستقلة عمرها ثمانية أيام. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أسبوعين، تتضمن يوماً كاملاً واحداً وعدة أيام تتراوح مدة العمل فيها من ساعة إلى ثلاث ساعات. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر إضافة المحاليل على الفور حتى لا تجف القطع بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى، مثل المجهر الإلكتروني المناعي، لتحديد توزيع الخلايا التي تعبر عن بروتينات معينة بعد تطورها. وقد أتاحت لنا هذه التقنية دراسة ليس فقط نمط الخلايا المتبوغة، بل وأيضاً نمط خلايا الخيوط الكاذبة في مستعمرات croce CCI. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية طمر مستعمرات الخميرة من أجل التقطيع النسيجي.

لا تنسَ أن العديد من كواشف الفحص المجهري المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن أن تكون خطيرة للغاية. يرجى تذكر استخدام خزانة استرداد الغازات (fume hood)، وارتداء الملابس الواقية، والتخلص من الكواشف بشكل صحيح. حسناً، هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة. تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.