الطاقة البيولوجية التجربة الملف باستخدام الخلايا Myoblast C2C12

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار الحالة الوظيفية للمتقدرات (mitochondria) في الخلايا الحية والمتقدرات المعزولة من خلال قياس معلمات متعددة للأيض التأكسدي باستخدام محلل التدفق خارج الخلوي XF 96. وتتمثل هذه المعلمات في التنفس الأساسي، ومعدل دوران ATP، وتسرب البروتونات، والتنفس الأقصى أو السعة التنفسية الاحتياطية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة مُعدِّلات محددة للتنفس المتقدر بشكل متسلسل إلى خلايا أرومات عضلية من نوع C two C 12، وقياس التغير في معدل استهلاك الأكسجين، أو OCR، وهو مؤشر على التنفس، وتحويل الجلوكوز إلى لاكتات، وهو ما يولد ATP من خلال تحلل السكر.

يتم قياس مسار الطاقة الرئيسي الآخر في الخلايا أيضًا كـ ECAR أو معدل التحمض خارج الخلية. ويمكن الحصول على نتائج توصيف الميتوكوندريا التي توفر رؤية حول الدور المركزي الذي تلعبه وظيفة الميتوكوندريا في تحديد عمر الخلايا. مرحبًا، اسمي ديفيد نيكولز.

لقد كنتُ باحثاً متخصصاً في الميتوكوندريا طوال مسيرتي المهنية، وكانت أهم قطعة معدات استخدمتُها في دراساتي هي قطب الأكسجين. فإذا تمكنت من قياس معدل امتصاص الأكسجين تحت ظروف مختلفة باستخدام الميتوكوندريا المعزولة، فستحصل على معلومات هامة للغاية. ولكن عند الانتقال إلى الخلايا، وخاصة الخلايا التي تُزرع في أطباق متعددة الآبار أو على شرائح غطاء مجهرية، فإن الطرق التقليدية لا تجدي نفعاً.

تعتبر هذه مشكلة كبيرة، وقد تم التغلب عليها قبل بضع سنوات من خلال تطوير مقايسة في أطباق متعددة الآبار تتيح لنا دراسة تنفس الخلايا على التوازي في تنسيق طبق متعدد الآبار. ما ستشاهدونه اليوم هو تجربة بسيطة للغاية ولكنها غنية بالمعلومات، صممناها من أجل مراقبة الوظيفة الأساسية للطاقة الحيوية في الميتوكوندريا في الخلايا المستزرعة. للبدء، قم بزراعة الخلايا في أطباق زراعة الخلايا XF 96 بمعدل 10,000 خلية لكل بئر في 100 µL من وسط النمو، وضعها في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C مع 10% ثاني أكسيد الكربون.

يمكن تحليل الخلايا في جهاز XF 96، بعد مرور 24 ساعة من استزراعها باستخدام المقايسة. يقوم معالج المقايسة (Assay Wizard) بإنشاء نموذج بتوزيع المجموعات التالي: تحتوي الأعمدة من 1 إلى 12 جميعها على 10,000 خلية من نوع C 12.

تُستخدم المجموعة الأولى الملونة بالأزرق كخلايا ضابطة. بينما سيتم إعطاء المجموعة الثانية الملونة بالأحمر من العقاقير كل من oligo Mycin وFCCP وroone. بعد ذلك، قم بتحضير المركبات في وسط المقايسة X-F-D-M-E-M كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول.

أوليغوميسين (Oligo Mycin)، وFCCP، وروتنون (rotten known). هذه المركبات موزعة مسبقاً في مجموعة اختبار الإجهاد الميتوكوندري XF cell MIT. باستخدام محطة تحضير XF، استبدل وسط النمو بوسط التشغيل DMEM.

أخيراً، قم بتحضين الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة للسماح للخلايا بالوصول إلى حالة توازن مسبق مع وسط المقايسة قبل إضافة المركبات القابلة للحقن إلى خرطوشة المستشعر؛ قم بتدفئة المركبات حتى تصل إلى 37 °C. ثم قم بتحميلها في منافذ الحقن على النحو التالي: بالنسبة للأعمدة من واحد إلى أربعة، قم بتحميل 16 و18 و20 µL من وسط مقايسة XF أو DMEM في المنافذ A وB وC على التوالي.

بالنسبة للأعمدة من الخامس وحتى الثاني عشر، ضع 16 µL من all liga mycin في المنفذ A، و18 µL من FCCP في المنفذ B، و20 µL من rot known في المنفذ C. بعد ذلك، حدد أوامر البروتوكول بضبط التكرار (loop) على ثلاث مرات، والخلط (Mix) على ثلاث دقائق، والقياس (measure) على ثلاث دقائق. أخيراً، انقر على بدء (start).

اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة، والتي ستوجه المستخدم إلى موعد تحميل الخرطوشة عند اكتمال المعايرة. اتبع مطالبات المستخدم وأضف لوحة الخلايا الخاصة بالتجربة. ثم انقر فوق متابعة واسمح ببدء إجراء المقايسة.

قم بإزالة الطبق عند انتهاء التجربة. اشتُق هذا المقايسة من التجربة الكلاسيكية المخصصة لتوصيف الوظيفة الميتوكوندرية، وهي تعمل كإطار عمل يمكن من خلاله بناء تجارب أكثر تعقيداً تهدف إلى فهم تأثيرات المركبات المختلفة على عملية التمثيل الغذائي الخلوي، والوظيفة الميتوكوندرية، والأنشطة الحيوية الطاقوية الشاملة. وهنا لاحظنا الاستجابة المتوقعة في معدل استهلاك الأكسجين مع معالجة الخلايا بكل سلسلة من المركبات.

انخفض مستوى الـ ATP نتيجة تثبيط تخليقه عند المعقد الميتوكوندري الخامس بسبب مادة الـ Oligomycin. وبما أن الخلايا لم تعد قادرة على تخليق الـ ATP عبر الفسفرة التأكسدية بعد المعالجة بـ Oligomycin، فقد ارتدت إلى تحلل السكر لتلبية حاجتها من الـ ATP. وبناءً على ذلك، لاحظنا زيادة في ECAR، وهو معدل التحمض خارج الخلوي، والذي يعد مؤشراً على تحلل السكر كما تم توضيحه سابقاً. يعمل FCCP كعامل فك اقتران ويزيل القيد المفروض على إعادة دخول البروتونات.

تتسارع عملية التنفس وتصبح الآن محدودة بنقل الإلكترونات. وأخيرًا، يقوم الـ rote known بتثبيط المعقد الميتوكوندري الأول، مما يؤدي إلى توقف تدفق الإلكترونات في سلسلة نقل الإلكترونات، وبالتالي ينخفض استهلاك الأكسجين بشكل كبير. ومن هنا يتم الحصول على معلومات حول التنفس الأساسي للخلايا، والنسبة المئوية لاستهلاك الأكسجين المخصص لإنتاج TP، بالإضافة إلى الكمية المخصصة للحفاظ على تدرج البروتونات الناتج عن تسرب البروتونات.

علاوة على ذلك، يمكننا الحصول على الحد الأقصى لمعدل التنفس في ظل ظروف التنفس غير المقترن، والتي يُشار إليها أحيانًا بالسعة التنفسية الاحتياطية. وأخيرًا، يمكننا تحديد كمية استهلاك الأكسجين التي لا تعود إلى العمليات الميتوكوندرية. لقد رأيت هذا للتو باستخدام جهاز seahorse.

تعد XF 96 سلسلة من التجارب التي توفر قدراً هائلاً من المعلومات حول طاقة الـ BIE للميتوكوندريا في الخلية. وتمنحك التجربة الأساسية، والتي تكتسي أهمية بالغة ونطلق عليها التجربة رقم واحد، معلومات عن التنفس الأساسي، ومعدل دوران الـ TP، وتسرب البروتونات الميتوكوندري، والسعة التنفسية الاحتياطية. وتوفر لك هذه المعايير هذه المعلومات الجوهرية حول الحالة الحيوية الطاقية للميتوكوندريا في الخلية.