جمع متغير تركيز الكالوري المعايرة متحاور مجموعات البيانات من أجل تحديد آليات ملزمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد النموذج الفيزيائي الصحيح الذي يصف ارتباط جزيء ضخم بربيطته وتحديد المعاملات الديناميكية الحرارية المرتبطة بذلك. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير محلول مخزون من الجزيء الضخم من خلال عملية دياليز مكثفة. بعد ذلك، يتم إذابة الربيطة المعنية في محلول الدياليز النهائي، ثم تُحدد تركيزات جميع المكونات في الخطوة الثانية.

يتم تخفيف عينات الجزيئات الكبيرة والرابط بعناية إلى سلسلة من التركيزات المختلفة. بعد ذلك، تُجرى سلسلة من تجارب قياس مسعر التفاعلات الحرارية المتماثلة، أو تجارب ITC، عند عدة تركيزات لكل من الرابط والبروتين لإنتاج سلسلة من المنحنيات الحرارية لـ ITC في الخطوة النهائية من الإجراء. ويتم إجراء تحليل شامل لسلسلة التجارب باستخدام نماذج فيزيائية مختلفة، ويتم تحديد النموذج الذي يحقق أفضل توافق إجمالي على أنه النموذج الصحيح.

سأعرض لكم اليوم طريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على تساؤلات في الفيزياء الحيوية، مثل كيفية ارتباط جزيئات البروتين بروابطها، ويمكنها توفير قياسات دقيقة لمعاملات الارتباط مثل الإنتروبيا، والإنثالبيا، وثوابت الارتباط. قبل البدء في هذا البروتوكول، قم بتنقية البروتين المستهدف؛ والجزيء الضخم المستخدم في هذا العرض التوضيحي هو immuno GLYCOSIDE N six prime، وهو subtle transferase one I أو C six prime one I. للبدء، قم بتحضير أربعة لترات من محلول الديلزة المنظم وبردها إلى 4 °C. بعد ذلك، قم بإجراء الديلزة لحجم صغير من محلول الجزيء الضخم.

في هذه الحالة، يتم وضع خمسة مليليترات من 400 micromolar AAC C six prime, one eye في 1.3 لتر من محلول الديلزة المنظم عند درجة حرارة 4 °C. يمكن إجراء ذلك في غرفة تبريد أو ثلاجة، مع استبدال المحلول المنظم بمحلول جديد كل ثماني ساعات، وإجراء الديلزة ثلاث مرات إجمالاً. يتم الاحتفاظ بمحلول الديلزة النهائي.

قم بترشيح 750 milliliters من محلول الديلزة النهائي عبر مرشح سليلوز بمسامية 0.45 micron واحفظه عند درجة حرارة أربع degrees Celsius. سيُستخدم هذا المحلول المنظم، والذي سيُشار إليه الآن باسم محلول التشغيل (running buffer)، لعمليات الشطف وكعامل تخفيف. وبالنسبة للعينات، قم بشطف مرشح حقنة بمسامية 0.2 micron جيداً باستخدام محلول التشغيل.

قم بوضع عينة البروتين وقم بترشيحها. اجمع العينة برفق في أنبوب مخروطي قبل تخزين محلول البروتين، ثم حدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة بروتينية قياسية. في هذه الحالة، يتم قياس تركيز البروتين عن طريق الامتصاصية عند 280 nanometers ويتم حساب تركيز الإنزيم.

باستخدام معامل الانقراض الناتج عن خادم EXI البروتومي، يتم تخزين البروتين بطريقة تضمن أقصى قدر من الاستقرار على المدى الطويل. يجب تخزين AAC C six prime one eye عند درجة حرارة 4 °C لأنه لا يحتفظ بنشاطه بعد التجميد والإذابة، ثم يتم إذابة الليجاند ومحلول التشغيل. وفي هذا العرض التوضيحي، تمت إذابة 4 mg من acetyl coenzyme A في 200 µL من محلول التشغيل لتحضير محلول مخزون بتركيز 25 mM.

يمكن تخزين هذا الربيطة عند درجة حرارة -78 °C حتى يحين وقت استخدامها لتحضير عينات ITC؛ أولاً، قم بحساب تركيز الإنزيم للحصول على قيمة C تبلغ 64 كما هو موضح في البروتوكول المكتوب لـ AAC 6'1. وهذا يتوافق مع تركيز يبلغ 192 µM. قم بتحضير محلول بحجم 2 mL من الجزيء الضخم بهذا التركيز، عن طريق تخفيف المحلول المخزون باستخدام محلول التخزين المفلتر. قم بإذابة محلول acetal co-enzyme a في حمام مائي مثلج. وبمجرد ذوبان محلول acetal co-enzyme a، امزجه برفق. احسب تركيز محلول الربيطة عن طريق ضرب تركيز الجزيء الضخم في عدد مواقع الارتباط ثم ضرب الناتج في 10.

قم بتحضير محلول أسيتيل مرافق الإنزيم أ عن طريق إضافة 80 µL من المحلول المخزون لأسيتيل مرافق الإنزيم ACE بتركيز 25 mM إلى 420 µL من محلول التلامس (running buffer) ثم المزج. انقل محلول أسيتيل مرافق الإنزيم ACE المخفف إلى أنبوب تعبئة الماصة، وأعد المحلول المخزون المتبقي بتركيز 25 mM إلى درجة حرارة -78 °C للتخزين. قم بإزالة الغازات من محلولي A C six prime one eye وأسيتيل مرافق الإنزيم أ تحت التفريغ لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 19 °C، وهي درجة أقل بـ 1 °C من درجة حرارة التشغيل التجريبية المطلوبة.

لتجهيز سرنجة الحقن، أدخل السرنجة عبر حامل السرنجات حتى يصبح مشبك السرنجة المثبت مسبقاً في نفس مستوى ارتفاع الحامل. مرر مشبك السرنجة الثاني فوق سرنجة الحقن حتى يتم ضغطه بإحكام مقابل الجزء السفلي من حامل السرنجات. أحكم ربط المشبك برفق باستخدام مفتاح سداسي برأس كروي مقاس 0.05 inch المرفق.

بعد ذلك، ضع حامل المحقنة في حامل الماصة. مرر حاقن الماصة برفق داخل محقنة الحقن، وتأكد من دخول طرف المكبس مباشرة في فتحة المحقنة. وبمجرد إدخاله بالكامل، قم بربط طوق القفل الخاص بحامل المحقنة في حاقن الماصة.

قبل تحميل محلول عينة بروتين A a C six prime one eye، استخدم نظام غسل الخلية الملحق بالجهاز لغسل خلية العينة بما لا يقل عن 50 milliliters من محلول التشغيل المنظم. قم بإزالة المنظم المتبقي من خلية العينة عن طريق الشفط باستخدام محقنة زجاجية ذات إبرة طويلة سعة 2.5 milliliter. قم بإزالة المحاليل من مفرغة إزالة الغازات باستخدام إبرة طويلة ثانية نظيفة وجافة.

سرنجة سعة 2.5 milliliter. اسحب بعناية ما لا يقل عن 1.8 milliliters من عينة بروتين A a C six prime one eye إلى السرنجة. توخ الحذر لتجنب تكون فقاعات الهواء.

بمجرد ملء المحقنة بعينة البروتين، أدخل الإبرة في خلية العينة والمس قاع الخلية برفق. ارفع الإبرة بمقدار 1 millimeter تقريباً، ثم احقن العينة برفق داخل الخلية حتى يظهر السائل الزائد فوق الجزء العلوي من خلية العينة. ولطرد أي فقاعات هواء محتبسة من الخلية، ارفع الإبرة بمقدار 1 centimeter تقريباً مع التأكد من بقاء المحلول في منطقة الفائض، ثم اسحب واحقن بسرعة حوالي 0.25 milliliters من المحلول.

الآن، حرك الإبرة ببطء إلى الأعلى على طول جانب فتحة التصريف. ستصطدم الإبرة بحافة في بئر العينة. اسحب كل السائل الموجود فوق هذه الحافة، حيث تشير الحافة إلى الارتفاع المطلوب لمحلول التشغيل.

لتحميل حقنة الحقن، قم بتوصيل حقنة نفخ الأنبوب البلاستيكي بفتحة التعبئة، ثم اخفض طرف المكبس إلى أعلى فتحة التعبئة. الآن، ضع أنبوب تعبئة الماصة الخاص بمحلول ربيطة DGAs في أسفل حامل الماصة. تأكد من أن طرف الحقنة لا يلامس قاع أنبوب التعبئة، واسحب المحلول ببطء إلى داخل الحقنة حتى تدخل كمية صغيرة في أنبوب حقنة التحميل.

بعد ذلك، أغلق منفذ التعبئة عن طريق خفض طرف المكبس. يتم ذلك بالنقر فوق زر إغلاق منفذ التعبئة. ثم قم بإزالة أي فقاعات هواء قد تكون قد حُبست أثناء عملية التحميل.

قم بعملية التطهير وإعادة الملء من خلال النقر على زر التطهير وإعادة الملء (purge refill). كرر عملية التطهير وإعادة الملء ثلاث مرات إجمالاً. وبمجرد اكتمال عملية التطهير وإعادة الملء، قم بإزالة أنبوب الملء من حامل الماصة وامسح طرف المحقنة برفق باستخدام مناديل مختبرية.

الآن، قم بخفض سرنجة مجموعة الماصة داخل العينة. يجب توخي الحذر والمتابعة ببطء لأن الإبرة قد تنثني بسهولة. تأكد من إدخال السرنجة بالكامل عن طريق الضغط لأسفل على قاعدة طوق القفل.

بمجرد تثبيت المحقنة، اضبط درجة حرارة التشغيل المطلوبة واختر قدرة مرجعية تكون أكبر قليلاً من أقصى تدفق حراري متوقع عند الحقن. في هذا المثال، تم استخدام 20 degrees Celsius و 20 micro calories per second كدرجة حرارة التشغيل والقدرة المرجعية على التوالي. ثم قم ببرمجة أحجام الحقن وفترات التأخير المطلوبة.

هنا، يتم استخدام 28 حقنة، حيث يبلغ حجم الحقنة الأولى 2 µL مع تأخير قدره 62 ثانية، بينما تبلغ سعة الحقنات اللاحقة 10 µL مع تأخير قدره 332 ثانية. وتوفر التجربة الموضحة هنا الأساس لإنشاء مجموعة بيانات بتركيز واحد لتوليد المنحنيات الإضافية اللازمة. كرر هذه العملية مع تقليل تركيزات الجزيئات الكبيرة والربيطات.

تأكد من أن جميع عينات الجزيئات الكبيرة والربائط مستمدة من نفس المحلول المخزون لتقليل الخطأ في التركيزات. يظهر هنا تتبع قياس السعرات الحرارية بالمعايرة المتساوية الحرارة الخام الناتج عن معايرة 3.86 millimolar من الربيطة acetyl coenzyme A في 192 micromolar من الجزيء الصغير A A C six prime one.

استُخدمت القيم المتكاملة للعين لتحديد معاملات الارتباط باستخدام ملاءمة تتابعية لموقعين. يوضح هذا الرسم البياني متساويات الحرارة التي تم إنشاؤها بواسطة قياس السعرات الحرارية بالمعايرة (ITC) لتركيزات متنوعة من ACE Coenzyme A و AAC C six Prime One Eye. وقد تمت ملاءمة البيانات التجريبية، الممثلة بالدوائر المفتوحة، لكل من نموذج الموقعين المستقلين والنموذج التتابعي لموقعين.

يُلاحظ توافق أفضل مع نموذج الموقعين المتسلسلين. تم تحديد تركيزات البروتين المستخدمة في النص المصاحب. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توخي الدقة الشديدة في التخفيف لأن التغير في التركيزات يمكن أن يكون له تأثير جذري على نتائجك.