الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

الهدف العام من هذا الإجراء هو استنتاج الانتحاء الفيروسي لدى مريض مصاب بـ HIV عن طريق تسلسل منطقة V3 في جين الغلاف الفيروسي؛ وذلك بالبدء باستخلاص H-I-V-R-N-A من بلازما دم المريض. بعد ذلك، يتم تضخيم منطقة V3 من بروتين HIV GP one 20 باستخدام nested R-T-P-C-R. ثم يتم التحقق من وجود الناتج باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام، يليه إجراء تسلسل قائم على الجمهرة لنواتج V3 المضخمة.

أخيراً، يتم تحليل التسلسلات باستخدام برنامج تحديد القواعد النيتروجينية (base calling software) واستنتاج استخدام المستقبل المشترك باستخدام خوارزمية "genome to pheno". وفي نهاية المطاف، يمكن لهذه النتائج أن تبين ما إذا كانت المجموعة الفيروسية للمريض من نوع R5 أو غير R5 من خلال تسلسل قائمة على المجتمع لحلقة HIV-1 V3. لذا، فإن الميزة الأساسية لهذا الاختبار الخاص بالمجموعة الفيروسية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المقايسات المعتمدة على الخلايا المظهرية، هي إمكانية إجرائه في أي مختبر مجهز بأجهزة التسلسل بتكلفة منخفضة وفي وقت أقل وبكمية أقل من المادة البدائية.

تعتبر هذه التقنية ذات صلة بالعلاج باستخدام مضادات الفيروسات القهقرية لأنها يمكن أن تحدد ما إذا كان من المرجح أن تستجيب المجموعة الفيروسية لدى المريض لمضادات CCR5 من 500 µL من البلازما. استخدم جهاز استخلاص EasyMag الآلي لاستخلاص HIV RNA. انتقل الآن إلى غرفة تنظيف PCR لإعداد RT-PCR لضمان أخذ عينات كافية من المجموعة الفيروسية.

خطط لإجراء كل تفاعل نسخ عكسي في ثلاث مكررات ضمن هذا التفاعل أحادي الخطوة. استخدم الرنا الفيروسي لتخليق الـ CDNA، مع تضخيم منطقة HIVV three تحديداً باستخدام SQV three F1 و CO 6 0 2 prime repair. بناءً على مكونات التفاعل الواحد.

قم بإعداد محلول خليط مخزون كافٍ لعدد العينات المراد تضخيمها باستخدام ماصة تكرارية. أضف 36 µL من خليط العينات إلى كل بئر من آبار صفيحة PCR. انتقل الآن إلى استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل ميكرولترات من مستخلص عينة RNA إلى كل بئر من الآبار المحددة. احرص على تغيير الرؤوس بين كل عملية إضافة.

بمجرد اكتمال عملية النقل، قم بتغطية الآبار بأغطية شرائط PCR. ثم ضع لوحة PCR في جهاز التدوير الحراري المبرمج لإجراء تفاعل R-T-P-C-R من خطوة واحدة لمنطقة HIVV three. وبالنسبة لتفاعل PCR المتداخل، استخدم بادئات SQV three F two و CD four R.

احسب كمية الكاشف المطلوبة لعدد العينات المراد تضخيمها في غرفة نظيفة مخصصة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتحضير مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (nested PCR)، ثم استخدم ماصة مكررة لتوزيع 19 µL لكل بئر في طبق PCR نظيف. عند الانتهاء من تفاعل R-T-P-C-R، انتقل إلى غرفة ما بعد التضخيم.

استخدم ماصة متعددة القنوات ذات ثماني قنوات لنقل 1 µL من قالب R-T-P-C-R إلى مزيج nested PCR. قم بتغيير الرؤوس بين كل عملية إضافة. غطِّ الآبار بأغطية PCR الشريطية وانقل اللوحة إلى جهاز الدورات الحرارية (thermocycler) لإجراء عملية التضخيم.

أخرج اللوحة من الجهاز المدوّر الحراري بعد عودة درجة الحرارة إلى 25 °C. وللتأكد من تضخيم المنطقة V3 بنجاح، قم أولاً بتحليل النواتج عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. قم بتحضير هلام Agarose بتركيز 1.6% مع صبغة CyberSafe للهلام.

باستخدام ماصة متعددة القنوات بسعة 10 µL، انقل 8 µL من عينات PCR إلى الآبار المخصصة لها. كما يجب تحميل سلم DNA في بئر واحد على الأقل في كل صف.

قم بتشغيل الهلام عند جهد يبلغ حوالي 100 فولت لمدة 10 دقائق. قم بتصور النطاقات باستخدام الفلورة فوق البنفسجية ووثق الصورة عن طريق التصوير الفوتوغرافي. سجل العينات التي نجحت فيها جميع عمليات التضخيم الثلاثية.

إذا لزم الأمر، كرر عملية R-T-P-C-R للعينات التي تحتوي على أقل من ثلاثة تضخيمات للمنتج. يتم التحقق من عينات الـ CDNA الفيروسية المضخمة بشكل إضافي من خلال تفاعلات تسلسل الـ DNA التي ستجرى باستخدام البادئات V 3 0 2 F و S QV three R one. أخرج كاشف big di من المجمد واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة.

احسب وجهّز الكواشف المطلوبة لعدد العينات المراد تحليلها. وزع خمسة ميكرولتر 5 µL من خليط تفاعل التسلسل في آبار اللوحة المناسبة باستخدام ماصة متعددة القنوات. غطِّ اللوحة بمنديل Kim wipe وضعها جانباً.

وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز تخفيف بنسبة 1 إلى 15 لناتج PCR المُضخم عن طريق إضافة 180 microliters من الماء المعقم إلى ناتج PCR المتبقي. استخدم الماصة لنقل one microliter من العينة المخففة إلى قاع الآبار المناسبة في الطبق. احرص دائماً على تغيير الرؤوس بين العينات عند اكتمال عملية نقل العينة.

أغلق اللوحة باستخدام أغطية شرائط وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس لمدة ثانية واحدة. ولطرد اللوحة مركزياً، اضبط السرعة على 140 5G. وعندما تصل سرعة الدوران إلى 140 5G، أوقف عملية الدوران.

ضع الطبق في جهاز التدوير الحراري (thermocycler) للسماح بحدوث التفاعل. في كل بئر، قم بترسيب DNA باستخدام 4 µL من خلات الصوديوم بتركيز 3 M و 40 µL من الإيثانول المبرد بتركيز 95%، ثم أغلق الأغطية بإحكام. قم برج الطبق باستخدام جهاز الرج (vortex) لمدة 10 ثوانٍ، ثم انقر على الطبق لإزالة أي فقاعات هوائية.

ضع الأطباق عند درجة حرارة -20 °C لمدة تتراوح بين 30 دقيقة وساعتين. استرجع الـ DNA عن طريق الطرد المركزي عند 2000 ×g لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة أغطية الشرائح والتخلص منها.

اقلب الصفيحة فوق حاوية النفايات واسكب السائل الطافي. تخلص من أي سائل طافٍ متبقٍ عن طريق تجفيف الصفائح المقلوبة باستخدام مناديل ورقية.

اطوِ ورقتين من المناشف الورقية لمحاصرة الطبق بينهما. ضع الطبق ووجهه لأسفل في جهاز الطرد المركزي وقم بالتدوير عند 140 5G. أوقف عملية التدوير عندما تصل السرعة إلى 140 5G.

ثم يتم الغسل باستخدام 155 µL من الإيثانول بتركيز 95% ثم يتم سكب السائل. بعد ذلك، تُكرر عملية الطرد المركزي. تُترك اللوحة لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق للسماح بتبخر أي كمية متبقية من الإيثانول.

من أجل مسخ عينات DNA، استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 10 µL من صبغة عالية الكثافة المخصصة لـ maide في جميع آبار اللوحة، بما في ذلك الآبار الفارغة. أغلق اللوحة باستخدام septima وضعها في جهاز التدوير الحراري عند 90 °C لمدة دقيقتين. وأخيرًا، ضع لوحة العينات في لوحة تسلسل ثم ضعها في جهاز التسلسل.

تتمثل إحدى الطرق المقبولة لتحليل البيانات في استخدام برنامج recall لإجراء عملية تحديد القواعد النيتروجينية (base calling) تلقائياً دون أي تدخل بشري. يعد Recall برنامجاً مجانياً ومخصصاً لتحديد القواعد النيتروجينية؛ قم بتسجيل الدخول واختيار ملفات العينات المراد رفعها باستخدام خيار التصفح (browse). حدد موقع ملف بيانات التسلسل الخام وارفع ما يصل إلى 20 megabytes.

بعد ذلك، قم بتعيين التسلسل المرجعي إلى V three. انقر فوق "معالجة البيانات" (process data). اختر المجلد الناتج في الجانب الأيمن من الصفحة لعرض قائمة العينات.

تعتبر العينات الموضحة باللون الأحمر فاشلة، بينما تعتبر العينات الموضحة باللون الأخضر ناجحة. من خلال النقر على عينة محددة ثم الضغط على زر العرض، يمكنك مراجعة التسلسل، واتباع التعليمات الموجودة على الجانب الأيمن من الصفحة للتنقل عبر التسلسل، وتنزيل الملفات في مجلد مضغوط بصيغة zip.

يمكن استنتاج الانتحاء الفيروسي من التسلسلات الناتجة عن التسلسل القائم على المجتمع باستخدام خوارزمية المستقبل المساعد من النمط الجيني إلى النمط الظاهري. من القائمة المنسدلة للإعدادات الهامة، اختر "الخيار الأمثل" بناءً على تحليل البيانات السريرية من motivate 2% و 5.75%FPR. الآن اختر تحميل أو لصق تسلسل لإجراء التحليل.

تعتبر ملفات FASTA مقبولة. لا تضف ملفات أخرى، وتابع للحصول على تنبؤ geno Tono FPRA لمدى الاستجابة لمضادات CCR five. يوفر تقرير G two P الناتج تسلسل الحلقة V three بالأحما eels الأمينية ويوضح المواضع ذات الصلة للطفرات المرتبطة بالفيروس غير المستجيب لـ R five.

يتم تقديم معدل الإيجابية الكاذبة في أسفل التقرير وتفسيره من حيث الاستجابة لمضاد CCR five. يمكن تنزيل هذا التقرير كملف PDF. إذا تم استنتاج أن أيًا من التسلسلات الثلاثة من العينة غير R five، فمن غير المرجح أن يستجيب المريض لمضاد CCR five كما هو متوقع؛ حيث يشير الفصل الكهربائي للهلام لنتائج RTP CR Amplifications الخاصة بـ HIV one V three loop إلى أن ليس جميع العينات السريرية تنتج منتجاً.

يمكن تصور التسلسلات الناتجة من العينات المضخمة في مخطط كروماتوغرافي يتم قراءته بواسطة برنامج recall. ومن المتوقع الحصول على تسلسل نقي مع وجود القليل من المزيجات. وفي بعض الأحيان، قد تكون التسلسلات غير واضحة وغير قابلة للتعيين الدقيق للقواعد.

قد يتم تحديد بعض المرضى على أنهم يحملون فيروسات غير مستخدمة لمستقبل CCR5 كما هو موضح هنا. ومن غير المرجح أن يستجيب هؤلاء المرضى للعلاج بمضادات مستقبل CCR5. ومع ذلك، تبين أن غالبية المرضى لديهم مجموعة فيروسية تتكون من فيروسات تستخدم مستقبل CCR5، وهو ما يشير إليه المربع الأخضر في أسفل تقرير تحليل G2P.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربعة أيام تقريبًا من البداية إلى النهاية، بدءًا من عملية الاستخلاص وصولاً إلى التحليل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية التنبؤ بالميول الفيروسية باستخدام طرق التسلسل القائمة على المجموعات السكانية بالاشتراك مع خوارزمية genome pheno المعلوماتية الحيوية.

حسناً، هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم، وبالتوفيق في تجاربكم.