البولي ايثيلين جلايكول كفاءة تحويل ساطة (PEG) من موس Physcomitrella patens

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحويل بروتوبلاست SCO Metre. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق هضم النباتات باستخدام Drizly. بعد ذلك، يتم غسل البروتوبلاست باستخدام المانيتول لإزالة Drizly، ثم تُحضن مع DNA وpeg.

أخيراً، يتم توزيع البروتوبلاستات المحولة على أطباق ثم تُحضن. وفي النهاية، يمكن الحصول على النتائج التي تظهر البروتوبلاستات المحولة وهي تعبر عن بروتينات مُعلمة فلورياً من خلال المجهر الفلوري. وسيقوم Y lu، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها فعالة وتنتج باستمرار بروتوبلاستات تعبر عن البروتين المطلوب. لعزل بروتوبلاستات الحزازيات، ابدأ بإضافة 9 mL من المانيتول بتركيز 8% في طبق بتري باستخدام ملعقة مسطحة. ضع حزازيات يتراوح عمرها من خمسة إلى سبعة أيام من طبقين إلى ثلاثة أطباق PP NH4 في المانيتول. يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق لهذا الإجراء ولوصفات الكواشف الإضافية. بعد ذلك، أضف 3 mL من 2%drizly واحضن العينة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف لمدة ساعة واحدة.

قم بترشيح الخليط عبر مشبك بمسامية 100 micron للحصول على معلق أخضر متجانس. ثم قم بتدوير الراشح بسرعة 250 G لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي بحذر شديد.

أعد تعليق البروتوبلاستات في 500 µL من المانيتول بتركيز 8%. ثم أضف 9.5 mL إضافية من المانيتول بتركيز 8%. تأكد من تعليق البروتوبلاستات بشكل كامل.

كرر خطوات الغسل مرتين إضافيتين عن طريق تدوير المحلول مرة أخرى عند 250 G لمدة خمس دقائق. تخلص من الطافي ثم أعد تعليق البروتوبلاستات، أولاً في 500 ميكرولتر.

ثم يتم إضافة 9.5 milliliters من mannitol بتركيز 8% باستخدام مقياس خلايا الدم (hemo cytometer). قم بعدد البروتوبلاست في 10 µL من المعلق لتحويل DNA إلى البروتوبلاست المعزولة. أولاً، قم بطرد مركزي خليط البروتوبلاست عند 250 ×g لمدة خمس دقائق.

أزل السائل الطافي وأعد تعليق البروتوبلاستات بتركيز 1.6 مليون لكل ملليلتر في محلول MMG. حضن المعلق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، أضف 600 µL من محلول البروتوبلاستات إلى أنبوب زراعة يحتوي على 60 µg من DNA. رج الأنبوب.

أضف 700 µL من محلول PEG الكالسيوم برفق ثم رجّ الأنبوب. حضّن العينة جيداً في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة خلال فترة الانتظار هذه. قم بتغطية أطباق PRMB بـالسيلوفان.

بعد ذلك، خفف المعلق باستخدام 3 mL من محلول W5 ثم قم بالتدوير عند 250 G لمدة خمس دقائق. ولإزالة PEG، أعد تعليق البروتوبلاست في 2 mL من PRMT، ثم وزع 1 mL على كل طبق PRMB مغطى بـ cellophane. احتفظ بالأطباق عند درجة حرارة 25 °C في غرفة نمو.

أخيراً، بعد أربعة أيام من عملية التحويل، انقل السيلوفان إلى أطباق انتخاب جديدة. يوضح هذا الشكل مثالاً لنباتات عمرها 18 يوماً تم تجديدها من البروتوبلاست، والتي حُوِّلت باستخدام 15 micrograms من الـ DNA البلازميدي فائق الالتفاف الذي يحمل شريط مقاومة للهيجروميسين. هنا، تم تحويل 30 micrograms من نفس الـ DNA البلازميدي فائق الالتفاف إلى البروتوبلاست.

تم تحويل 60 micrograms من DNA الملتوي في هذه العينة. وأخيرًا، تم تجديد هذه النباتات من البروتوبلاست التي حُولت باستخدام 120 micrograms من نفس DNA البلازمي فائق الالتواء الذي يحمل كاسيت مقاومة الـ hygromycin. ولا تتأثر كفاءة التحويل بتركيزات DNA التي تصل إلى 60 micrograms.

ومع ذلك، فإن التركيزات الأعلى من DNA تكون ضارة بهذا الإجراء. وتشير البيانات إلى أن هذه الطريقة تعطي نتائج متسقة عبر نطاق واسع من كميات DNA في المرة الواحدة. ويمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق إضافية مثل تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNAi) العابر وتعطيل الجينات للإجابة على أسئلة إضافية حول وظيفة الجين.