واحد المجهر الإلكتروني التعمير الجسيمات مجمع Exosome باستخدام أسلوب عشوائي الخيمة المخروطية

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على البنية ثلاثية الأبعاد لمعقد الإكسوسوم باستخدام طريقة الإمالة المخروطية العشوائية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترسيب طبقة رقيقة من غشاء الكربون على شبكة الكربون المثقبة لإنشاء الركيزة الداعمة للمعقد البروتيني، ثم إضافة الصبغة كخطوة ثانية. يتم وضع العينة والصبغة على الشبكة، مما يؤدي إلى غمر العينة في أملاح المعادن الثقيلة.

يتم بعد ذلك إجراء المجهر الإلكتروني للحصول على أزواج مائلة من الصور المجهرية للعينة. وفي النهاية، يتم الحصول على نتائج تظهر البنية ثلاثية الأبعاد لمعقد الإكسوسوم بناءً على تحليل الصور باستخدام طريقة الإمالة المخروطية العشوائية. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبات لأن تحضير العينة بشكل جيد لطريقة الإمالة المخروطية العشوائية يكون صعباً في بعض الأحيان، وكذلكما هو الحال بالنسبة لإجراءات معالجة الصور التي تلي ذلك.

يُعد استعراض هذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم خطوات تحديد الدرجة وتحضير العينة دون توضيح لعملية تقييم العينة. تتطلب مبدأ طريقة الإمالة المخروطية العشوائية التقاط زوج من الصور المجهرية لنفس المنطقة من العينة داخل المجهر الإلكتروني؛ حيث يتم التقاط صورة واحدة للعينة في وضع غير مائل، وتُؤخذ الصورة الأخرى للعينة وهي مائلة بزاوية تتراوح بين 50 و70 درجة. وباستخدام الحاسوب، يتم وضع زوج الصور المجهرية الرقمية جنباً إلى جنب، ويتم في هذا التوضيح تحديد الصور الخاصة بالجسيمات ذاتها.

يتم تمييز هذه الصور بأرقام في إحداثيات ثلاثية الأبعاد. وترتبط صور الجسيمات غير المائلة ونظيراتها المائلة ببعضها البعض من خلال اتجاه محور الميل وزاوية الميل. إن محاذاة صور الجسيمات غير المائلة تنقل صور الجسيمات المائلة إلى مواقعها المقابلة في asMule؛ وباستخدام صور متعددة للجسيمات المائلة التي تملأ الحيز السمتي، يمكن إعادة بناء البنية ثلاثية الأبعاد للجزيء باستخدام خوارزمية الإسقاط الخلفي. لتصنيع الشبكات أولاً، قم بتحضير محلول form VAR بتركيز 0.5% عن طريق إضافة 0.45 grams من راتنج poly vinyl formal و 90 milliliters من الكلوروفورم إلى كؤوس زجاجية سعة 100 milliliter.

داخل خزانة استرداد الأدخنة، غطِّ البيكر بورق الألومنيوم وأذب راتنج form var. باستخدام قضيب تحريك صغير وجهاز تحريك مغناطيسي، يستغرق الراتنج حوالي 15 دقيقة ليذوب. وفي هذه الأثناء، نظف شرائح المجهر الزجاجية المنظفة مسبقاً باستخدام الميثانول ومناديل Kim wipes.

بعد ذوبان راتنج form var تمامًا في الكلوروفورم، أضف 1 mL من الجلسرول بتركيز 50% إلى سطح المحلول. يؤثر تعديل حجم الجلسرول المضاف على كثافة الثقوب في الكربون المثقب.

اغمر رأس جهاز الموجات فوق الصوتية في المحلول. عند عمق حوالي بوصة واحدة، استخدم أقصى طاقة لإجراء عملية السونيكة لمدة دقيقة واحدة، مما سيؤدي إلى تكوين مستحلب من قطرات الجلسرول في شكل محلولنا. ستؤدي عملية السونيكة لفترة أطول إلى تصغير حجم الثقوب في الكربون المثقب.

يصبح المحلول حليبياً بعد هذه الخطوة. فور الانتهاء من عملية الغمر بالموجات فوق الصوتية، تُوضع الشرائح الزجاجية النظيفة عمودياً في المستحلب. وبعد ثانية واحدة، تُخرج الشرائح ويُجفف الجزء السفلي منها باستخدام ورق ترشيح لتكوين غشاء بلاستيكي رقيق على سطح الشرائح.

بعد تبخر الكلوروفورم، افحص كثافة وحجم الثقوب في الغشاء باستخدام مجهر ضوئي. يجب أن تؤدي ظروف التحضير الموضحة هنا إلى تكوين 10 إلى 20 ثقبًا في كل مربع من شبكة 400 mesh، بقطر يتراوح بين ثلاثة وأربعة micrometers. بمجرد جفاف الشرائح الزجاجية، قم بقص حافة الغشاء البلاستيكي الموجود على سطح الشريحة.

قم بطفو الغشاء على سطح ماء مقطر عن طريق غمس الشريحة عمودياً في الماء. يمكن ملاحظة الغشاء الرقيق على سطح الماء بزاوية مائلة مقابل انعكاس الضوء. ضع شبكات نحاسية بمسامية 400 mesh على الغشاء، واحدة تلو الأخرى بحيث يكون السطح الأملس للشبكة مواجهاً لأسفل.

ارفع الغشاء البلاستيكي الذي يحتوي على الشبكات باستخدام قطعة من الورق. اقلب الورقة واتركها لتجف. في طبق بتري، انقع الورقة في الميثانول لإزالة الجلسرول المتبقي في الثقوب، ثم اترك الورقة لتجف في الهواء.

استخدم مبخر الكربون لطلاء الشبكات بطبقة من الكربون يصل سمكها إلى 20 nanometers تقريبًا، مع الاعتماد على وقت التبخير للتحكم في السمك المطلوب. يمكن تحديد السمك من خلال مقارنة اللون الرمادي للكربون باللون الرمادي لطبقة كربون ذات سمك معروف.

انقع الشبكات ذات الطبقة الكربونية في الكلوروفورم داخل طبق بتري زجاجي لمدة نصف ساعة لإزالة الـ form var، ثم يؤدي تجفيف الشبكات إلى الحصول على شبكات كربونية مثقبة مُحضرة منزلياً. بعد ذلك، قم بترسيب طبقة رقيقة من الكربون بسمك يبلغ حوالي 5 nanometer على سطح ميكا مقطوع حديثاً. ثم ضع الشبكات الكربونية المثقبة بعناية فوق قطعة من ورق الترشيح تحت الماء المقطر.

في جهاز مُصنّع محلياً، قم بتعويم الكربون الرقيق من سطح الميكا على سطح الماء ثم رسبه ببطء على شبكات الكربون المثقبة. ارفع ورق الترشيح الذي يحتوي على الشبكات واتركه ليجف. في خزانة استرداد الأدخنة، ابدأ بعملية الصبغ السلبي لمعقد الإكسوسوم عن طريق تحضير محلول فورمات اليورانيوم بتركيز 2% طازج.

كما هو موضح في الإجراء المكتوب، قم بتغطية أنبوب المحلول بقطعة من ورق الألومنيوم. ولمنع التعرض للضوء، يجب استخدام المحلول في نفس اليوم. قم بإجراء تفريغ توهجي لطبقة رقيقة من الكربون فوق شبكة كربونية بالكامل باستخدام جهاز التفريغ التوهجي. بعد ذلك، ضع قطعة من البارافيلم النظيف على طاولة المختبر، ثم انقل ثلاث قطرات بحجم 50 µL من محلول صبغة فورمات اليورانيل فوق البارافيلم، خفف معقد الإكسوسوم إلى تركيز يقارب 50 nM باستخدام محلول التخفيف المنظم، ثم انقل 4 µL من البروتين المخفف حتى الشبكة التي خضعت للتفريغ التوهجي.

اترك العينة على الشبكة لمدة دقيقة واحدة، ثم جفف المحلول المتبقي بقطعة من ورق الترشيح باستخدام ملقط. اقلب الشبكة فوراً فوق قطرة الصبغة الأولى واشطف الشبكة بتحريكها ذهاباً وإياباً عدة مرات لمدة 10 ثوانٍ تقريباً. كرر هذه العملية لكل قطرة من قطرات الصبغة الثلاث، وبعد الشطفة الأخيرة، اترك الصبغة على الشبكة لمدة دقيقة إضافية.

بعد ذلك، قم بتجفيف الصبغة باستخدام قطعة من ورق الترشيح. حافظ على وجود طبقة رقيقة من محلول الصبغة على سطح الشبكة واترك الشبكة لتجف داخل خزانة استخلاص الغازات. ضع شبكة العينة في حامل العينات ثم ضع الحامل داخل مجهر إلكتروني من طراز FEI TE nine 12.

افحص شبكة العينة بتكبير منخفض للعثور على المربعات الأفضل صبغاً. يبدو المربع الجيد وكأنه يحتوي على اثنتي عشرة فتحة بأبعاد تتراوح بين 1 إلى 2 µm ومناطق مصبوغة داكنة بداخلها. قم بتفعيل وضع الجرعة المنخفضة (low dose mode) في واجهة مستخدم FEI، ثم قم بمحاذاة بؤرة البحث وموضع التعريض في وضع الجرعة المنخفضة.

اضبط البحث على وضع الجزء (fraction mode) بطول كاميرا يبلغ 1.5 meter. اضبط التركيز على تكبير 150 K، واضبط التعريض على تكبير 50 K مع زمن تعريض مقاس قدره ثانية واحدة. عادةً ما تُستخدم ميزة مميزة على الشبكة في كل من وضعي البحث والتعريض لإجراء عملية المحاذاة.

حدد الثقوب ذات التلوين الجيد في وضع البحث واحفظ مواقعها. التقط صورة بجهاز CCD للمربع. قم بإمالة العينة بزاوية 55 درجة والتقط صورة أخرى.

قارن بين الصورتين وحدد الثقوب المتقابلة في المجهرين. أعد إمالة المنصة إلى صفر درجة. استخدم مجموعة الجرعات المنخفضة لالتقاط صور لكل ثقب تم تحديده في وضع البحث بتكبير عالٍ ومع قيمة إزاحة بؤرية تبلغ حوالي -0.7 micrometers.

بعد التقاط صور لجميع الثقوب، قم بإمالة المنصة بزاوية 55 درجة مع استخدام نفس التكبير. التقط صوراً مجهرية للعينة المائلة مع إزاحة بؤرية (defocus) تبلغ حوالي -1.2 micrometers. حدد زوج الصور المجهرية المائل المقابل بناءً على الأنماط الموجودة في الصور المجهرية ذات التكبير المنخفض، وذلك باستخدام النمط غير المنتظم لشبكات الكربون المثقبة المصنعة يدوياً.

للمساعدة في عملية الارتباط، اختر أزواج ميل الصور المجهرية التي تتميز بتوزيع منتظم للجزيئات وخالية من الهالات المحيطة بها. يجب استبعاد الصور المجهرية التي تظهر حولها هالات صبغية واضحة عند معالجة البيانات. ابدأ بإعداد البرنامج في الإجراء.

سيتم استعراض معالجة الصور باستخدام العملية 2D في حزمة Eman. ولتغيير تنسيق الصور، تُستخدم حزمة iMagic five لإجراء المحاذاة 2D وحزمة spider. ولإجراء إعادة البناء والتدقيق ثلاثي الأبعاد (3D)، يتم تحويل الصورة الرقمية DM three Gatan إلى تنسيق صور spider.

باستخدام أمر process 2D، قم باختيار أزواج الجسيمات. وباستخدام البرنامج الشبكي الموزع ضمن حزمة برنامج spider، يقوم البرنامج تلقائيًا بحفظ إحداثيات الجسيمات واستخراج جميع الجسيمات المختارة باستخدام نص spider البرمجي. ويقوم النص البرمجي بحفظ مجموعات الجسيمات المائلة وغير المائلة.

قم بتحويل الجسيمات غير المائلة من صيغة UN إلى صيغة IMAG five. باستخدام برنامج EM two EM، قم بتطبيق مرشح تمرير النطاق (band pass filter) وقناع على الجسيمات غير المائلة باستخدام أمر InCorp prep في برنامج IMAG five، ثم قم بتوسيط الجسيمات المقنعة بمرشح تمرير النطاق باستخدام أمر center. في برنامج IMAG five، قم بمحاذاة الجسيمات وتصنيفها بشكل تكراري إلى فئات متجانسة باستخدام نص برمجي دفعي (batch script) يقوم بتنفيذ برامج IMAG five تلقائيًا.

بعد ذلك، استخدم الأمر names in class في برنامج IMAG five لإنشاء جدول بحث لفئات الجسيمات، ثم أنشئ ملف رسم بياني لقيم الإزاحة والدوران للمحاذاة لكل جسيم باستخدام الأمر header. في برنامج iMagic five، قم بتحويل الجسيمات المحاذات إلى صيغة spider باستخدام برنامج EM two EM. ثم قم بتحويل جدول بحث الفئات إلى ملفات مستندات spider.

يتم أيضاً تحويل قيم الإزاحة والدوران للمحاذاة لكل جسيم إلى ملف مستند spider، ثم يتم تطبيق مرشح تمرير النطاق والقناع وتوسيط الجسيمات المائلة تماماً كما هو الحال بالنسبة للجسيمات غير المائلة في IMAG five، لإنشاء مجموعة بيانات جديدة للجسيمات المائلة الممركزة. قم بإنشاء ملفات مستندات زاوية من مستندات محاذاة المراجع المتعددة الناتجة عن IMAG five وملفات DCB الناتجة عن البرنامج الشبكي. استخدم نص back projection البرمجي في spider للحصول على نموذج أولي واحد لكل متوسط فئة.

أخيرًا، قم بإجراء تحسين للإسقاط للحجم الأولي باستخدام نص spider البرمجي مقابل جميع الجسيمات غير المائلة للحصول على الحجم النهائي باستخدام RCT. تم الحصول على حوالي 50 إعادة بناء للإكسوسوم. يتم توليد الأحجام من الجسيمات المائلة المقابلة لكل جسيم في الفئات الـ 50 من الجسيمات غير المائلة.

باستخدام الإسقاط الخلفي المطبق في حزمة spider، تم إجراء تحسين مطابقة الإسقاط باستخدام هذه الأحجام كنماذج أولية، وتم توليد الحجم ثلاثي الأبعاد المعروض للإكسوسوم بدقة تبلغ حوالي 18 angstrom، ويمكننا بعد ذلك دمج النماذج الذرية للأجزاء المختلفة من المعقد في الخريطة ثلاثية الأبعاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام RCT للحصول على عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد، بدءاً من توليد شبكة عينة ذات تباين جيد وصولاً إلى الصور المجهرية، وأخيراً الحصول على إعادة البناء باستخدام تقنيات تحليل الصور. وبالإضافة إلى البروتوكول الذي وصفناه هنا، هناك عدة طرق للحصول على عمليات إعادة البناء النهائية في تحليل الصور.

تتمثل الخطوة الأكثر أهمية للحصول على إعادة بناء صحيحة وموثوقة في العمل باستخدام عينة مُعدة جيداً.