الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحديد الدقيق للمستويات النسبية للتعديلات ما بعد الترجمة ضمن تحضيرات من النوكليوسومات الخلوية الكلية التي تم الحصول عليها من مليون خلية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير مستنبتات متجانسة وعالية الجودة من الخلايا الثديية أولاً، ثم عزل النوى من الخلايا عن طريق التفكيك الميكانيكي باستخدام مجانس "داونز" (Dounce homogenizer) والطرد المركزي.

تتمثل الخطوة التالية في الحصول على نيوكليوسومات سليمة عن طريق هضم الكروماتين الموجود داخل النوى وإجراء سلسلة من عمليات الاستخلاص ناقصة التوتر. وأخيراً، يتم فحص النيوكليوسومات باستخدام مقايسة ELIZA مع الضوابط المناسبة لتحديد تعديلات ما بعد الترجمة النوعية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح المستويات النسبية لتعديلات محددة موجودة ضمن عينات النيوكليوسومات.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل لطخة وسترن (western blotting) والترسيب المناعي للكروماتين (chromatin immunoprecipitation) في إمكانية تحديد صورة شاملة لعدد من حالات تعديل النيوكليوسوم بسهولة. وتعد هذه الطريقة أكثر حساسية ودقة من لطخة وسترن، ويمكن إجراؤها في معظم المختبرات المجهزة لتجارب البيولوجيا الجزيئية العامة. كما يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الخلايا الجذعية وعلم الوراثة فوق الجينية، مثل ما يحدث عند وقوع أحداث التمايز وإعادة البرمجة الرئيسية.

لبدء الإجراء، قم أولاً بهضم الخلايا باستخدام 3 mL من التريبسين لكل طبق بقطر 15 cm للحصول على خلايا مهضومة حديثاً. أضف 20 mL من محلول PBS butyrate البارد جداً. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL وقم بطرد الأنبوب مركزياً لتجميع الخلايا عند 1000 RPM لمدة خمس دقائق، ثم اسحب السائل الطافي وأضف 10 mL من محلول PBS butyrate البارد جداً للغسل، ثم قم بطرد معلق الخلايا مركزياً مرة أخرى عند 1000 RPM لمدة خمس دقائق.

تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 4 mL من محلول التحلل المنظم (lysis buffer) مع مثبطات البروتياز كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد ذلك، انقل الخلايا باستخدام الماصة إلى جهاز التجانس (homogenizer) من النوع B ذو اليد الهاونة على الثلج، وقم بالتجانس باستخدام 20 ضربة. ثم انقل المتجانس إلى أنبوب طرد مركزي على الثلج.

قم بطرد العينة مركزياً عند 2000 G لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية، التي تحتوي على المواد السيتوبلازمية، وأعد تعليق الراسب.

قم بتعليق الراسب في 2 mL من محلول الغسيل المنظم C المبرد بالثلج مع مثبطات البروتياز، ثم ضع المادة المعاد تعليقها بلطف فوق وسادة سكروز بتركيز 30% وحجم 5 mL في أنبوب طرد مركزي مبرد. لعزل النوى، قم بإجراء الطرد المركزي عند 2,400 G لمدة 5 دقائق باستخدام دوار ذي دلاء متأرجحة؛ حيث ستنتقل النوى عبر الوسادة بينما تبقى الحطام الخلوية عند السطح الفاصل. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة كامل الحجم السائل بعناية وأعد تعليق النوى في 250 µL من محلول الغسيل المنظم C المبرد بالثلج مع مثبطات البروتياز، ثم انقل النوى إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.

لبدء عملية عزل النوكليوسومات، أضف 3 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar إلى النوى وضعها في حمام مائي جاف (heat block) عند درجة حرارة 37 °C حتى تتوازن درجة الحرارة. بعد ذلك، أضف وحدتين من إنزيم micro cocal nuclease مذابة في 10 µL من منظم micro cocal nuclease، واترك العينة لتحضن لمدة 12 دقيقة عند 37 °C. اخلط المزيج بشكل متكرر باستخدام رأس الماصة.

بعد الحضن، أوقف التفاعل بإضافة 6 µL من sodium EDTA pH 8 بتركيز 0.5 M، ثم ضع العينة على الثلج للتبريد. بعد ذلك، قم بطرد العينة مركزياً عند 2000 ×g لمدة 4 دقائق، وعقب الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 300 µL من sodium EDTA بتركيز 0.2 mM، ثم احضن العينة على الثلج لمدة ساعة واحدة مع السحب والضخ اللطيف من حين لآخر للمزج.

بعد إجراء عملية الطرد المركزي عند 3000 G لمدة أربع دقائق في درجة حرارة أربع درجات مئوية، يتم جمع الطافي الذي يحتوي على النيوكليوسومات الحرة في أنبوب طرد مركزي جديد ويُحفظ على الثلج لاستخدامه لاحقاً في إعادة استخدام النيوكليوسومات. يتم تعليق الراسب في 300 µL من 0.2 mM من sodium EDTA كما سبق، ويُحضن على الثلج لمدة ساعة واحدة مع الخلط اللطيف من حين لآخر.

بعد فترة الحضن، قم بطرد العينة مركزياً. مرة أخرى، ادمج السائل الطافي الناتج مع العينة المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الثلج. لبدء مقايسة إليزا (ELISA) للنيوكليوزوم، قم بتعبئة طبق إليزا ذو 96 بئراً بسلسلة تنازلية من خمس تخفيفات تسلسلية بمقدار ضعفين من النيوكليوزومات ومحلول التغليف المنظم، بدءاً من 0.1 micrograms لكل 50 microliters في البئر العلوي، ويجب تعبئة جميع سلاسل التخفيف في ثلاث نسخ مكررة.

تذكر تضمين آبار تحتوي على محلول التغطية فقط كضوابط. قم بتحضين الصفيحة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، وفي اليوم التالي، استخدم جهاز غسل الصفائح لغسل الصفائح بـ 200 µL لكل بئر من PBS بتركيز 0.5% بين 20 في درجة حرارة الغرفة أربع مرات، لمدة إجمالية قدرها 10 دقائق.

أضف الآن 100 µL من محلول الحجب لكل بئر، ثم قم بالتحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز تدوير (rotator). بعد انتهاء فترة التحضين، تخلص من منظم الحجب عن طريق هز اللوحة المقلوبة بقوة فوق الحوض. بعد ذلك، أضف الجسم المضاد الأولي المخفف بحجم 50 µL لكل بئر في محلول مكون من 5% PSA في 0.05% بين 20 في PBS، ثم قم بتحضين المحلول لمدة ساعة واحدة على جهاز تدوير في درجة حرارة الغرفة.

بعد تحضين الأجسام المضادة الأولية، اغسل الأطباق كما سبق باستخدام غسالة الأطباق. وبمجرد اكتمال إجراء الغسيل، أضف 50 µL لكل بئر من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة ببيروكسيداز الفجل (horseradish peroxidase) والمخففة في PBS مع 5% BS، A، و 0.5%20، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على جهاز تدوير (rotator). بعد تحضين الأجسام المضادة الثانوية، اغسل الأطباق كما سبق.

استخدم غاسلة الأطباق لتطوير الطبق. أضف 50 µL من ركيزة TMB Eliza إلى كل بئر وقم بالتحضين لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة، ستتحول آبار طبق ELIZA إلى اللون الأزرق، وستكون كثافة اللون متناسبة مع كمية تعديلات النيوكليوسوم الموجودة في كل منها.

بعد ذلك، قم بإيقاف التفاعل عن طريق إضافة 50 µL من حمض الكبريتيك العادي في كل بئر. سيتغير اللون إلى البني، ثم قم بطرد اللوحة مركزياً بسرعة 1500 RPM لمدة دقيقتين للتخلص من أي فقاعات هوائية.

أصبح الطبق الآن جاهزاً للقياس الكمي باستخدام قارئ أطباق قياس الألوان. وأخيراً، يتم قياس امتصاصية الطبق عند 450 نانومتر وتصدير النتائج لتحليلها. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون يومين إذا نُفذت بشكل صحيح بعد مرحلة التطوير.

فتحت هذه التقنية الباب أمام الباحثين في مجال أبحاث الخلايا الجذعية لاستكشاف الاستجابات فوق الجينية لعمليات التمايز وإعادة البرمجة على مستوى البروتينوم فوق الجيني بأكمله.