تصنيع جهاز ميكروفلويديك للتجزئة سوما الخلية العصبية والمحاوير

مرحبًا بكم في مختبر الدكتور نيولي جون. يتخصص مختبر جون في هندسة المنصات الموائع الدقيقة للتطبيقات البيولوجية. سنقوم في هذا الفيديو بعرض إنتاج واستخدام جهاز موائع دقيقة مصمم لتقسيم واستزراع العصبونات الأولية.

تم نشر جهاز العصبونات لأول مرة في مجلة Nature Methods في أغسطس من عام 2005. ومنذ تقديمه، استخدم جهاز العصبونات على نطاق واسع من قبل متعاونين في جميع أنحاء العالم. يتكون جهاز العصبونات من قطعة من PDMS تم صبها على رقاقة سيليكون تحتوي على نمط SUA الخاص بالجهاز، والذي تم إنشاؤه مسبقاً عن طريق الطباعة الضوئية.

يتميز الجهاز بثلاث ميزات رئيسية: أربعة خزانات بقطر 8 mm، وقناتان رئيسيتان بعرض 1.5 mm وطول 7 mm وارتفاع 100 µm، بالإضافة إلى أخاديد دقيقة بعرض 10 µm وارتفاع 3 µm تربط بين القناتين الرئيسيتين. يمكن أن يتراوح طول الأخاديد الدقيقة من 150 µm إلى 900 µm، وإن كان الطول القياسي المختار هو 450 µm. وعند معاينة الجهاز بحيث تكون القنوات الرئيسية والأخاديد الدقيقة في وضع رأسي، يمكننا ملاحظة أن الخزانات الموجودة على يسار الأخاديد متصلة عبر القنوات الرئيسية، وكذلك الحال بالنسبة للخزانات الموجودة على اليمين.

تتيح هذه الميزة تدفق السوائل عبر القناة الرئيسية، وهي ميزة مهمة تجعل من الممكن تحميل الخلايا وتغيير الأوساط الغذائية. يتميز جهاز العصبونات بثلاث مزايا رئيسية مقارنة بمنصات زراعة الأنسجة التقليدية؛ أولاً، فهو يسمح بتقسيم أجسام الخلايا (السوما) والمحاور العصبية إلى حجيرات منفصلة، مما يجعل من الممكن الحصول على أجزاء محورية نقية باستخدام جهاز العصبونات.

تسمح أحجام وأطوال الأخاديد الدقيقة للمحاور العصبية بالمرور عبر القناة الرئيسية الأخرى بينما تمنع أجسام الخلايا من العبور. ثانياً، وبفضل تصميم الجهاز والاستفادة من الضغط الهيدروستاتيكي، يمكن إخضاع جانب الخلايا أو جانب المحاور العصبية في الجهاز لمعالجات منفصلة ببساطة عن طريق الحفاظ على حجم الخزانات أعلى في أحد جانبي الجهاز مقارنة بالجانب الآخر. وثالثاً، يمكن قطع الجزء المحوري الصافي من الجهاز عن طريق الشفط بالتفريغ، مما يسمح للباحث بدراسة ومراقبة تجدد المحاور العصبية.

ستقوم الباحثة Hina Lee الآن بتوضيح كيفية تحضير جهاز العصبونات للموائع الدقيقة. يُستخدم رقاقة سيليكون بسمك 3 Ang وبها نمط مصنوع من SU-8 بواسطة التصوير الضوئي لصب قالب الموائع الدقيقة من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان PDMS. ونشير إلى رقاقة السيليكون ذات نمط SU-8 باسم القوالب الرئيسية أو ببساطة القوالب.

يتم خلط PDMS مع عامل المعالجة بنسبة وزنية تبلغ 10 إلى 1. أي، على سبيل المثال، 15 جرام من PDMS مقابل 1.5 جرام من عامل المعالجة. بعد ذلك، يتم خلط PDMS جيداً ثم يُصب فوق رقاقة السيليكون.

توضع رقاقة السيليكون داخل طبق بتري من البوليسترين بقطر 10 سنتيمتر. يتطلب تغطية القوالب الرئيسية (MAs) بسماكة تبلغ حوالي أربعة مليمتر استخدام ما يقرب من 12 جرام إلى 15 جرام من مادة PDMS. ثم يُوضع القالب الرئيسي مع مادة PDMS في مجفف تفريغ مع ترك غطاء طبق بتري مفتوحاً، ويتم تطبيق تفريغ هوائي.

يتم القيام بذلك للمساعدة في إزالة فقاعات الهواء من الـ PDMS التي دخلت أثناء تحريك عامل المعالجة. تستغرق عملية إزالة فقاعات الهواء حوالي 15 دقيقة. يتم إخراج القالب الرئيسي الذي يحتوي على الـ PDMS من المجفف بعد مرور 15 دقيقة في المجفف التفريغي.

لا تزال هناك بعض الفقاعات المتبقية على قالب PDMS الرئيسي. يُستخدم مسدس هواء مزود بمرشح 0.45 ميكرون لإزالة أي فقاعات متبقية. ثم يُوضع القالب الرئيسي على لوح تسخين بدرجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ليتم معالجته.

في حال عدم توفر مجفف تفريغ، يمكن ترك القالب في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات، حيث ستتلاشى الفقاعات الهوائية تلقائياً مع مرور الوقت. وفي حال عدم توفر لوح تسخين، سيتصلب PDMS في درجة حرارة الغرفة بعد مرور 24 ساعة.

من المهم التأكد من أن القالب مستوٍ خلال عملية المعالجة. وبمجرد معالجة PDMS على القالب، يتم رفعه ونقله إلى غطاء نظيف باستخدام شفرة جراحية، حيث يتم إجراء قطع دائري حول محيط الأجهزة.

من المهم عند إدخال الشفرة في الـ PDMS ملامسة رقاقة السيليكون، مع مراعاة عدم تسليط ضغط مفرط على الرقاقة لتجنب تشقق القالب الرئيسي بقطع دائري يحيط بالأجهزة بالكامل. يحتوي كل قالب سيليكون مقاس ثلاث بوصات على أربعة أجهزة. يتم رفع الـ PDMS بعناية عن القالب الرئيسي.

يمكن بدء هذه العملية عن طريق تدوير الشفرة الجراحية برفق أثناء إدخالها في القطع السابق. وتكون الأجهزة المصنوعة من PDMS رقيقة جداً فوق القالب. يتم ثقب الخزانات المواجهة للأعلى في الجهاز باستخدام أداة ثقب خزعة أنسجة بقطر ثمانية مليمتر.

يتم دفع البقايا المتبقية في الثاقب للخارج باستخدام قضيب. بعد ذلك، يتم تقسيم الأجهزة إلى أربعة أجزاء وقص فائض الـ PDMS بحيث يتناسب الجهاز بدقة مع غطاء Corning. ويُستخدم تيار من النيتروجين لإزالة أي بقايا زائدة من الزجاج رقم واحد بحجم 24 millimeter by 40 millimeter.

يمكن أيضاً إزالة البقايا المستعصية باستخدام شريط الفينيل 3M Scotch Brand 4 7 1. والأجهزة النظيفة الآن جاهزة للربط بالبلازما. يُستخدم جهاز تنظيف البلازما Herrick لربط أجهزة العصبونات بشرائح الغطاء لفترة وجيزة.

توضع الأجهزة والرقائق الزجاجية الغطائية على صينية، ثم توضع الصينية داخل جهاز تنظيف البلازما، ويُستخدم مضخة تفريغ لإزالة الهواء من الغرفة. ومن المهم ملاحظة وضع أجهزة PDMS بحيث يكون الوجه للأعلى؛ أي أن يكون وجه التصميم للأعلى لضمان تعرضه لغاز البلازما.

بعد وصول ضغط التفريغ إلى 300 millitorr، يتم تشغيل الطاقة في الملف الكهربائي وضبطها على درجة عالية. يُفتح الباب قليلاً للسماح بدخول كمية محدودة من الهواء إلى الغرفة، مما يساعد في توليد البلازما. يتم تعريض الأجهزة والغطاء الزجاجي لمعالجة بالبلازما لمدة دقيقتين.

لاحظ اللون الأرجواني في الغرفة. هذه هي البلازما الفعلية. يقوم الملف الكهربائي بتوليد البلازما، وهي غاز متأين جزئياً يتكون من إلكترونات، وأيونات، وذرات أو جزيئات متعادلة.

تولد البلازما أنواعًا تفاعلية على سطح الزجاج والجهاز، وعند وضعهما معًا، يتكون رابط دائم. كما تحول البلازما السطح ليصبح محبًا للماء، مما يساعد في تسهيل إضافة السوائل. كما يقوم منظف البلازما بتعقيم الأجهزة.

بعد المعالجة بالبلازما لمدة دقيقتين، يتم إيقاف تشغيل الطاقة في المفرغة ويُمرر الهواء إلى الغرفة. يتم تجميع الأسطح المعالجة بالبلازما للزجاج وجهاز الموائع الدقيقة بحيث تكون متلامسة مع بعضها البعض داخل وحدة عمل نظيفة. ثم توضع الأجهزة في أطباق معقمة قطرها 60 مليمتر.

تُشكل الأسطح المعالجة بالبلازما للزجاج والجهاز رابطة قوية غير قابلة للعكس. وفي غضون 10 دقائق من الربط بالبلازما، يتم تثبيت الجهاز على الزجاج ثم يُضاف polyol lysine إلى الجهاز. وبعد 10 دقائق، ستنخفض درجة ألفة الجهاز للمياه.

مما يجعل دخول الـ PLL إلى الجهاز أمراً صعباً. ومن المهم التحقق من وجود فقاعات هوائية في الجهاز بعد إضافة الـ PLL. وتتمثل إحدى الطرق السهلة لإزالة الفقاعات الهوائية الموجودة في استخدام ماصة P 200 مملوءة بـ 100 µL من السائل.

في هذه الحالة، ضع طرف الماصة التي تحتوي على PLL مباشرة عند فتحة القناة الرئيسية، ثم اضغط على P 200 بقوة. قد يتطلب الأمر تكرار هذه العملية عدة مرات، ولكن في النهاية ستعمل قوة الماصة على دفع الفقاعات للخارج. تُترك الأجهزة التي تحتوي على PLL لتحضن طوال الليل في حاضنة قياسية للمزارع النسيجية عند 37 درجة مئوية مع 5%CO2.

بعد 24 ساعة من الحضن مع PLL، تُغسل الأجهزة مرتين سريعاً باستخدام ماء منزوع الأيونات ومعقم بجهاز الأوتوكلاف. خلال هذه العملية، لا يتم إزالة السائل تماماً من القنوات الرئيسية، بل من الخزانات فقط؛ حيث إن إزالة السائل من القنوات الرئيسية سيؤدي إلى تكون فقاعات.

بعد شطفين سريعين، تُملأ الأجهزة مرة أخرى بمياه منزوعة الأيونات ومعقمة بالـ autoclave، ثم تُوضع مجددًا في الحاضنة لمدة ثلاث ساعات على الأقل أو طوال الليل. وفي اليوم التالي، بعد تحضين الأجهزة في الماء طوال الليل أو لمدة ثلاث ساعات على الأقل، تُنقل مرة أخرى إلى كبينة السلامة الحيوية وتُشطف مرتين بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، يُضاف إلى الأجهزة الوسط الغذائي العصبي القاعدي (neural basal media) الذي يحتوي على المكملات اللازمة، وهي B 27 والغلوتامات، لاستزراع الخلايا العصبية الأولية للجرذان.

توضع الأجهزة بعد ذلك مرة أخرى في الحاضنة لاستخدامها مستقبلاً. وأصبحت الأجهزة الآن جاهزة لاستزراع الخلايا العصبية. لقد استعرضنا في هذا الفيديو تقنية الليثوغرافيا اللينة التي نستخدمها في تصنيع أجهزة الخلايا العصبية الخاصة بنا.

يمكن استخدام هذه الأجهزة لاستزراع العصبونات وأنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية. تكمن الميزة الأساسية لهذه الأجهزة في القدرة على فصل وتقسيم استزراع أجسام الخلايا العصبونية على أحد جانبي الجهاز عن جزء محوري نقي على الجانب الآخر من الجهاز. سنوضح لكم في الفيديو التالي كيفية تحضير العصبونات القشرية الجنينية من الجرذان في اليوم 18 (E 18) وكيفية تحميل الخلايا في الجهاز.

هذا كل شيء من مختبر جون. شكراً لمشاهدتكم.