التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

يوضح هذا البروتوكول كيفية تصوير الأحداث الديناميكية في أجنة *C. elegans* المبكرة باستخدام بصريات Norky DIC أو الفلورسنس، وذلك عن طريق الاستعانة بمجاهر متوفرة على نطاق واسع وبرمجيات مفتوحة المصدر. يبدأ البروتوكول بشرح كيفية تشريح أجنة *C. elegans* وتثبيتها للتصوير. بعد ذلك، يتم مراجعة الإعداد الصحيح لبصريات DIC nor masky لضمان الحصول على صور مثالية بأعلى درجة من التفاصيل.

تتم أيضاً مراجعة معايرة الإضاءة والمجهر الفلوري العكسي واسع المجال لجمع بيانات صور فلورية جيدة بالتعاون مع برمجيات مفتوحة المصدر. يمكن للمجهرية الجيدة تصور الديناميكيات الخلوية في جنين نامٍ. وتعد التوضيحات المرئية لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن إعداد D iic Optics بشكل صحيح يعد أمراً صعباً نظراً لأن المصطلحات قد تكون مربكة والتقنية الصحيحة يصعب وصفها كتابياً.

بالإضافة إلى ذلك، يجب على الباحثين توخي الحذر لتقليل التعرض للضوء عند إجراء التصوير الفلوري. ومن أجل الحد من السُميّة الضوئية والبهتان الضوئي، ولتحضير الأجنة للتصوير، قم أولاً بإعداد محلولين للتثبيت؛ أحدهما هو الفازلين المذاب، والآخر هو محلول agar بنسبة 2 إلى 3% في محلول منظم.

يمكن تحضير أغاروز (arose) أكثر كثافة إذا كانت البنى المراد تصويرها هشة للغاية، مع الحرص على تجنب الغليان. يتم صهر كلا المحلولين المخزنين في الميكروويف ثم تخزينهما في صورة حصص مقدار كل منها من 4 إلى 5 مل. في يوم التصوير، يتم صهر حصة من محلول الفازلين في كتلة تسخين بدرجة حرارة 65 إلى 70 درجة Celsius وصهر حصة واحدة من محلول أغاروز في الميكروويف.

مرة أخرى، يجب تجنب الغليان. ثم وللحفاظ على هذه المحاليل في حالة صهر، تُحفظ في كتلة تسخين. بعد ذلك، قم بتغطية الجزء العلوي والسفلي من شريحتين بزناق من شريط لاصق مختبري، ثم ضع شريحة نظيفة بين الشريحتين الملتصقتين.

الآن، قم بوضع بضع قطرات من مادة Aros المصهورة باستخدام الماصة على شريحة نظيفة، ثم غطّها بشريحة نظيفة أخرى. ستنتشر مادة Aros لتشكل وسادة مربعة رقيقة، وبذلك تصبح وسادة الديدان جاهزة. استخدم مجهر تشريح وملقطاً من سلك البلاتين لنقل ديدان بالغة عددها اثنان إلى قطرة من المحلول المنظم بحجم 9 إلى 12 µL على غطاء شريحة مقاس 18 × 18 mm.

ثم قم بالقص. افتح الديدان باستخدام إبرة أو مشرط لتحرير الأجنة مع جعل جهة الآجار للأسفل. ضع وسادة الديدان فوق غطاء شريحة مقاس 18 في 18 مليمتر واستخدم الشفرة لإزالة أي زوائد من الآجار.

أخيرًا، لختم شريحة الغطاء، ضع محلول الفازلين المصهور على طول محيطها باستخدام فرشاة رسم أو عود أسنان. الخلايا الآن جاهزة للتصوير. عند وضع الشريحة على المجهر، تأكد من محاذاة المستقطبين بشكل متعامد مع بعضهما البعض.

تأكد من أن كلًا من الحواجز والمنشورات خارج مسار الضوء. إذا لم يكن المجال مظلمًا، فقم بتدوير المستقطب الموجود أسفل المكثف حتى يصبح مظلمًا. حدد موقع الأجنة باستخدام الشيئية بقوة تكبير 10 مرات.

ابحث بالقرب من أجسام الديدان عن مجموعات من الأجنة الصغيرة للحصول على عدة أجنة ضمن مجال التصوير. وتجنب الأجنة الموجودة داخل الدودة للحصول على أفضل الصور. وبمجرد تحديد موقع أفضل الأجنة، انتقل إلى عدسة شيئية ذات قوة تكبير أعلى.

الآن قم بتحويل مكعب المرشح إلى وضع تباين التداخل التفاضلي (DIC). بعد ذلك، أدخل منشور والستون العلوي للعدسة الشيئية في مسار الضوء، وأدر القرص الموجود في المكثف لاختيار منشور والستون السفلي الذي يتوافق مع العدسة الشيئية. بعد وضع المنشورات في مكانها، اضبط المنزلق الموجود أسفل هذا البرج ليتناسب مع الفتحة العددية للعدسة.

للحصول على إضاءة كولر المثالية، قم بتركيز المكثف حتى تظهر حافة حجاب المكثف بأقصى درجة من الوضوح. والوضوح الأقصى هو عندما تكون الحدود بين الضوء والسواد أكثر حدة أو دقة في التركيز. وللحصول على تباين مثالي، قم بضبط جدار التفاحة والمنشور عن طريق تدوير المقبض الموجود على المنزلق.

أصبح المجهر الآن جاهزاً للاستخدام تقريباً. حان الوقت للتحكم في بارامترات التصوير الإضافية على الكمبيوتر باستخدام برنامج micro-manager والبرمجيات مفتوحة المصدر. ابدأ بضبط كسب الكاميرا (camera gain) على صفر.

بعد ذلك، قم بتغيير إعدادات حفظ الملفات لتكون بتنسيق TIFF بـ 8 بت بدلاً من 16 بت. يمكن لاحقاً تحليل ملفات TIFF باستخدام برامج مفتوحة المصدر مثل Image J. بعد ذلك، اضبط مستوى الإضاءة بحيث تكون أسطع البكسلات أقل بقليل من مستويات التشبع. إذا تم تنفيذ كل شيء بشكل صحيح، ستبدو الصورة ثلاثية الأبعاد مع ظهور الضوء وكأنه يسقط بزاوية مائلة.

بعد أن تصبح الصورة واضحة تماماً، اختر الأجنة التي ترغب في تصويرها وقم برسم منطقة الاهتمام. إذا كان المجهر مزوداً بمحرك تركيز، فاستخدمه لجمع مستويات بؤرية متعددة عند كل نقطة زمنية. افتح نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد وقم بتحديد المستوى العلوي والسفلي لمجموعة Z stack عن طريق ضبط مقبض التركيز للعثور على أول وآخر مستوى بؤري تظهر فيه بعض حبيبات المح،

قم بتحديد حجم الخطوة. سيحدد هذا عدد المستويات البؤرية التي سيتم جمعها. الآن، قم بتحديد فاصل زمني يكون طويلاً بما يكفي لاقتناء جميع المستويات البؤرية.

يمكن ضبط النقاط الزمنية القصوى لتكون عالية جداً بحيث يستمر البرنامج في التقاط الصور حتى يتم إيقافه يدوياً. اضبط البرنامج لعرض الصورة الأخيرة التي تم التقاطها فقط بحيث يمكن مراقبة العملية. الآن قم بتسمية ملفات الصور وابدأ في عملية التقاط الصور.

ستتم مراجعة تحليل الصور بإيجاز في نهاية القسم التالي. إن إنشاء مقطع فيديو لبروتين GFP يشبه إلى حد كبير عمل أربعة مقاطع DIC لـ D nor Musky، ولكن يتم استخدام ملف تكوين يتضمن تحكماً برمجياً في التشتت الفلوري. بدلاً من ذلك، وبعد تحديد موقع الأجنة، تأكد من أن منشور walstone العلوي ليس في مسار الضوء وقم بتحويل مكعب المرشح إلى F-I-T-C-G-F-P.

إذا لم يتم ضبط هذا الإعداد تلقائياً عند بدء التشغيل باستخدام البرنامج، فتأكد من ضبط كسب الكاميرا (camera gain) على 255. يتم تعيين ملف الصورة بتنسيق tiff 16 bit. الآن، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء النافذ وانقر على التصوير المباشر (live imaging).

اضبط شدة مصدر ضوء UV ووقت التعرض لتحقيق نسبة إشارة إلى ضجيج جيدة لإشارة الفلوريسنس، ومع ذلك، حافظ على أقل قدر من التعرض للضوء للحفاظ على الخلايا. بعد ذلك، قم بتحديد الفاصل الزمني. حدد عدد النقاط الزمنية وعدد المستويات البؤرية، ثم ابدأ في عملية الحصول على الصور كما تم وصفها سابقاً.

لتحليل مقاطع الفيديو، استخدم برنامجاً مفتوح المصدر؛ برنامج Image J مع تثبيت ملحق micromanager. كما يمكن استيراد مقاطع الفيديو الكبيرة جداً إلى Image J باستخدام ملحق loci. يظهر هنا جنين من النوع البري (wild type) تم تصويره باستخدام nor masky، وبصريات DIC.

الجهة الخلفية تقع في أسفل اليمين، والجهة البطنية تقع في أسفل اليسار. يعرض المقطع تسلسلاً من الصور ذات المستوى البؤري الواحد التي تم جمعها كل 15 ثانية. تم ضبط التشغيل على 14 إطاراً في الثانية.

يعبر هذا الجنين عن الفلورة أثناء الانقسام الجنيني الأول، حيث يقع الطرف الخلفي هنا في الأعلى وإلى اليمين. يعرض هذا المقطع التغييرات في مستوى بؤري واحد كل 10 ثوانٍ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير الأجنة الحية باستخدام كل من بصريات DIC Naski والفلورة فوق المجهرية (epi fluorescence) لدراسة الأحداث الديناميكية.

نأمل أن يكون لديكم فهم أفضل لكيفية إعداد بصريات DIC Nomar للحصول على صور مثالية، وأن تدركوا أنه يمكنكم الحصول على بيانات فلورية عالية الجودة باستخدام إضاءة الفلورية فوق البؤرية (epi fluorescence)، وأنكم لستم معتمدين دائمًا على المجاهر الأكثر تقدمًا. كما يمكنكم تطبيق تقنيات التصوير هذه لفحص الأجنة التي تفتقر إلى وظيفة جين معين، وذلك لمزيد من الاستقصاء حول المتطلبات الجينية لأحداثكم المفضلة أثناء انقسام الخلايا أو نموها.