رسم الخرائط وتطبيق التعبير Flippase محسن شرك في اليرقات والكبار ذبابة الفاكهة CNS

الهدف العام من التجربة التالية هو تحسين تعبير GAL four من خلال استخدام ليباز محدد للأنسجة مع أدوات تحويل GAL 80. ويتم تحقيق ذلك عن طريق توليد مجموعة من خطوط ذباب الفاكهة المعدلة وراثياً بتقنية enhancer trap Philippe وتحديد نمط تعبير الليباز في الجهاز العصبي المركزي في كل خط. وباستخدام مراسل GFP، يمكن للكيمياء النسيجية المناعية وتقارير GFP التمييز بين تعبير GL والتعبير العصبي لتقاطع تعبير GAL four في خطوط ET flip ذات الأهمية عبر الذباب الذي يحتوي على أداة تحويل GAL 80 في النسل.

يمكن استخدام التحليل النسيلي لتحليل تدقيق تعبير GAL4، كما هو الحال في العين. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية استخدام سلالات تعتمد على تتبع المعزز جنباً إلى جنب مع أدوات تحويل GAL80، وذلك مع مجموعة سريعة من تحالفات GAL4 المتاحة بالفعل في مجتمع دراسات الذبابة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع هذا المفهوم ليشمل كائنات نموذجية ناشئة أخرى تعتمد على GALI four UAS مثل سمك الزيبرا.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في رسم خرائط الدوائر العصبية الكامنة وراء السلوك. وعلى الرغم من أن هذا البروتوكول يوضح استخدام flip base في مجموعة فرعية من الخلايا المستقبلة للضوء، إلا أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة التقاطعية لتحليل أنسجة أخرى، بما في ذلك الأنسجة غير العصبية، مع توصيف المزيد من خطوط enhancer trap lipase.

تعد تقنية GAL4/UAS تقنية مهمة ومستخدمة على نطاق واسع من قبل علماء بيولوجيا الذباب. ويكمن أحد التحذيرات المتعلقة بمعظم خطوط GAL4 في أنها تعبر عن نفسها بشكل واسع للغاية بحيث لا يمكن استخدامها لرسم خرائط سلوك الدماغ باستخدام طريقة FINGER. ومن غير الممكن ضبط تعبير GAL4 بدقة في الخلايا المستهدفة دون استخدام transgene من نوع ET-flip لتقييد تعبير خطوط GAL4 جزئيًا.

من المفيد أولاً معرفة نمط تعبير transgene ET flip x two في اليرقات النامية في مراحلها المتأخرة وفي البالغين لتصور تعبير flip a في الجهاز العصبي المركزي. قم بإجراء تزاوج بين ذكور تحمل transgene ET t flip X two المستهدف وإناث عذارى تحمل مراسل GFP لتعبير et flip من النسل. اجمع يرقات F1 في الطور الثالث المتجولة من أجل التشريح. ضعها في طبق S guard نظيف وأزل أي شوائب باستخدام فرشاة رسم واشطف الطبق مرة واحدة بـ one times PBS.

الآن املأ الطبق بمحلول PBS بارد جداً لتخدير اليرقات؛ وللوصول إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ليرقة ما، أمسك خطاف الفم باستخدام ملقط. أمسك الجلد القشري بالقرب من الطرف الكروي الأمامي الممتد وقم بتقشيره للخلف. سيبقى الجهاز العصبي المركزي (CNS) متصلاً بخطاف الفم جنباً إلى جنب مع بعض التراكيب الأخرى.

الآن، باستخدام الملقط، قم بإزالة جميع الهياكل الزائدة المحيطة بـ CNS أثناء تشريح CNS. انقل هذه الهياكل بشكل فردي إلى طبق Pyrex مكون من ثلاثة أقسام ممتلئ بـ PBS. بمجرد الانتهاء من تشريح جميع الـ CNS، قم بتثبيتها عن طريق غمرها بالكامل في 200 µl من 4%PFA على الثلج.

إذا طفا الجهاز العصبي المركزي (CNS)، فهذا يعني أنه لم يتم تنظيفه بالكامل من جميع الأنسجة المحيطة. في حال حدوث ذلك، استخدم ملقطًا لإعادة غمر الجهاز العصبي المركزي (CNS) في المثبت بعد التثبيت لمدة 15 دقيقة، ثم اغسل النسيج باستخدام PBS بارد جداً 3 مرات، وبعد ذلك اغسل النسيج ثلاث مرات أخرى في PBT بارد جداً. يصبح النسيج الآن جاهزاً للتصوير أو الوسم بالأجسام المضادة أو الحفظ في PBT عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لوقت لاحق.

يتم تجميع بالغين من الجيل الأول F1 من نفس التهجين المستخدم لإنتاج اليرقات وذلك قبل البدly التشريح. غُمر ما بين خمس إلى 10 ذبابات في إيثانول 95% مبرد لمدة 30 ثانية لإزالة الشمع الموجود على سطح القشيرة. ولإزالة الإيثانول، يتم غسل البالغين ثلاث مرات باستخدام محلول PBS بتركيز 1x مبرد بالثلج، وبعد الغسلة الثالثة، يتم نقل إحدى الذبابات إلى طبق sil guard بقطر 35 مليمتر مملوء بمحلول PBS بتركيز 1x مبرد بالثلج لتجهيز الذبابة البالغة للتشريح.

ضع العينة بحيث يكون الجانب البطني للأعلى، ثم أدخل دبوس تثبيت في منتصف البطن. ابدأ عملية التشريح باستخدام الملاقط لإزالة الأرجل. بعد ذلك، قم بإزالة جلد الرأس عن طريق تثبيت الرأس عند الدعامات، وفي الوقت نفسه تقشير الجلد من أسفل العين باتجاه أعلى الرأس.

باستخدام ملقط مدبب بعناية، قم بإزالة وتتبع الأنسجة المحيطة بالدماغ، لأن هذه الأنسجة تمتلك تألقاً ذاتياً قوياً يتسبب في طفو الدماغ أثناء عملية التثبيت. يمثل الدماغ جزءاً فقط من الجهاز العصبي المركزي (CNS) في البالغين، أما الجزء الآخر فهو الحبل العصبي البطني أو VNC في الصدر، ويجب تشريحه أيضاً.

أولاً، قم بإزالة كيوتيكل الصدر عن طريق تثبيت الذبابة عند قاعدة الساق الخلفية وسحب كيوتيكل الصدر برفق حتى قاعدة الرقبة. ثانياً، لكشف الحبل العصبي البطني (VNC)، قم بمباعدة نصفي كيوتيكل الصدر برفق. ثالثاً، قم بإزالة البطن من الصدر عن طريق التثبيت عند قاعدة الساق الثانية وسحب البطن بعيداً من المنطقة القريبة من القطعة البطنية الأولى.

رابعاً، يتم تنظيف VNC عن طريق تثبيته عند المنطقة العضدية وتمزيق الأنسجة المحيطة بـ VNC برفق. قم بتمزيق حلقة النسيج الضام المحيطة بالرباط العنقي واستمر في إزالة الأنسجة الزائدة أثناء جمع الدماغ. ثم يتم نقل كل من الدماغ و VNC كأزواج إلى طبق Pyrex سعة تسعة مليمترات مملوء بـ 1× PBS مبرد ومحفوظ على الثلج.

لتثبيت أنسجة البالغين، اغمرها في 4%PFA على الثلج لمدة 15 دقيقة. اتبع ذلك بثلاث غسلات بـ PBS بارد جداً وثلاث غسلات بـ PBT. تصبح الأنسجة الآن جاهزة للتصوير أو الوسم بالأجسام المضادة لتحليل تعبير الجين المنقول بدقة.

من المفيد وسم الجهاز العصبي المركزي (CNS) بعلامات عصبونية أو دبقية لتوفير إطار مرجعي؛ ابدأ بحضن النسيج عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل مع أجسام مضادة إما للعصبونات أو الخلايا الدبقية. في اليوم التالي، اغسل المستحضر خمس مرات باستخدام PBT ثم احضنه مع الجسم المضاد الثانوي الفلوري في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. قم بتغطية الطبق بورق القصدير لمنع التبييض الضوئي للجسم المضاد بعد انتهاء فترة الحضن.

اغسل العينة باستخدام PBS ثم قم بتثبيت العينة كاملة على شريحة. استخدم حلقة بلاستيكية من OSHA لمنع سحق الأنسجة بواسطة غطاء الشريحة. أصبح الجهاز العصبي الآن جاهزاً لفحص أنماط تعبير GFP و LL تحت المجهر الفلوري.

عادةً ما يتم فحص ثلاث إلى خمس مكررات لتحديد مدى قابلية تكرار نمط تعبير flip. يمكن استخدام نمط تعبير flip في سلالة flip، إلى جانب جينات منقولة أخرى لتغيير كيفية تعبير كابت GAL four وهو GAL 80. ويعد تغيير تعبير كابت GAL 80 طريقة فعالة لإجراء التغييرات.

في تعبير GAL4، تتمثل إحدى الطرق في إزالة تعبير GAL80 باستخدام transgene، حيث يقوم تعبير GAL80 بتعطيل GAL4، الذي يتسبب بخلاف ذلك في تنكس العين في جميع أنحاء العين. يُستخدم هنا خط ET flip hash 6 88 A لتقييم فعالية أداة تحويل GAL80 في مجموعة فرعية من المستقبلات الضوئية في نسل F1، مع مقارنة نمط العين المظهري بنمط العين المظهري للسلالات الأبوية. إن أي ظهور لتشوه في العين أو فقدان للتصبغ يؤكد أن نمط تعبير flip موجود في المستقبلات الضوئية وأن عملية إزالة GAL80 قد نجحت.

تتمثل استراتيجية تكميلية غير مكررة في عكس تعبير GAL 80 باستخدام نفس خط الـ flip المستهدف. هذه الاستراتيجية مشابهة جداً للاستراتيجية الأخرى، ولكن في هذه الحالة يتم تثبيط تصبغ ID والتحلل في نسل F1. في flip X اثنين.

التعبير عن المستقبلات الضوئية. بمجرد إتقان عملية تشريح الجهاز العصبي المركزي، يمكن إجراؤها في غضون خمس دقائق تقريبًا للبالغين ودقيقة واحدة ليرقات إذا نُفذت بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم استخدام ملاقط حادة لإزالة القصبات الهوائية والأنسجة المحيطة بكل من البالغين و Libre C و Ss. ومن المهم استخدام طبق خالٍ من المواد المثبتة لعملية التشريح. يتم حاليًا استخدام صدمة حرارية (Heat shock flip) لإنتاج مستنسخات عشوائية.

في المقابل، يسمح نظام enhancer trap flip بإنتاج مستنسخات قابلة للتكرار، مما يسهل إجراء التحليلات المورفولوجية والسلوكية. وتتمثل ميزة أخرى لطريقة finger في إمكانية تقييد أنماط تعبير GAL4 بشكل أكبر عن طريق استخدام سلالات إضافية تعتمد على anan trap flip وسلالات gal أخرى. أما نقطة الضعف في تكوين tubulin stop GAL 80 فهي أن بعض تركيبات GAL4 وUAS effectors، مثل LAG4 وU-A-S-K-I-R، غير متوافقة لأنها تؤدي إلى موت الذباب.

يمكن التغلب على هذه المشكلة بسهولة باستخدام مؤثر UAS شرطي، مثل UAS Shiri Ts، والذي يسمح بفحص السلوك عند درجات حرارة مقيدة كما هو متوقع. لن تعبر جميع خطوط lipase الماصة للمعزز (enhancer trap) عن مستويات عالية كافية من lipase لتكون مفيدة. ومع ذلك، توفر تقنية الإصبع الموضحة هنا نهجاً جديداً لباحثي الدروسوفيلا (drosophila) لتحسين التحليل الفسيفسائي إما للدوائر النمائية أو للسلوك.