تعديل الجذعية الجنينية الماوس الفحص خلية مقرها لقياس كفاءة قلبية التعريفي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد التنظيم الزمني الحاسم المطلوب لتمايز الخلايا العضلية القلبية في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تكوين أجسام جنينية في طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً لتوحيد عملية تكوين الأجسام الجنينية كخطوة ثانية. تُضاف المعدلات البروتينية أو الكيميائية إلى الأجسام الجنينية على مدار مسار زمني محدد مسبقاً، مما يتيح التحكم الزمني في المسارات الخاضعة للفحص.

بعد ذلك، يتم قياس أجسام EBS النابضة يدويًا لتحديد كفاءة تحريض مخططات تعديل الإشارات المختلفة. وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها المتطلبات الزمنية لمسارات الإشارات الأساسية لتمايز الخلايا العضلية القلبية بناءً على النسبة المئوية لأجسام EBS النابضة المتكونة، مع التأكيد باستخدام طريقة القطرة المعلقة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل القطرات المعلقة في أنها توحد وتبسط إجراءً يتطلب عمالة مكثفة، وتسمح بقراءة مباشرة للقياس الكمي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية، مثل تحديد عوامل التخثر الإشارية الأساسية التي توجّه التمايز نحو نوع الخلايا المطلوب. لبدء هذا الإجراء، قم بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران في أطباق زراعة خلايا بحجم 10 سنتيمتر باستخدام وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران المكمل بعامل تثبيط ليوكيميا. وعندما تصل الخلايا الجذعية الجنينية إلى درجة تلاقي تتراوح بين 50 إلى 70%، تصبح جاهزة للاستخدام.

قم بإزالة وسط ES وشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام 5 mL من محلول PBS المعقم. أضف 2 mL من trypsin EDTA بتركيز 0.05% إلى كل طبق، وحضن الأطباق عند 37 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإبطال مفعول trypsin EDTA بإضافة 3 mL من وسط ES لكل طبق، وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL.

قم بالطرد المركزي بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا بالكمية المطلوبة من وسط EB. قم بعدّ الخلايا ثم خففها لتصل إلى 5 × 10³ خلية لكل milliliter.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 µL من وسط EB الذي يحتوي على الخلايا إلى كل بئر من ألواح معايرة دقيقة ذات 96 بئراً ذات قاع مستدير. سيعتمد عدد ألواح الـ 96 بئراً المطلوبة على عدد الظروف والنقاط الزمنية للتجربة. ضع ألواح معايرة دقيقة ذات 96 بئراً ذات قاع مستدير في حاضنة مرطبة عند 37 °C و 5% carbon dioxide لتحديد النوافذ الزمنية الحرجة لمسارات التأشير الرئيسية لتكوين القلب.

تُضاف مُعدِّلات لمسارات تأشير محددة إلى الخلايا الجذعية الجنينية (ES cells). وفي أطباق ذات 96 بئراً مستديرة القاع، يُضاف مُعدِّل التأشير، بعد تخفيفه في الوسط الغذائي، إلى كل بئر في نقاط زمنية مختلفة. ويُستخدم نصف عدد الآبار في كل طبق ذي 96 بئراً لكل نقطة زمنية لبدء المعالجة.

تتم إضافة ضابط المركبة (vehicle control) إلى الـ 48 بئراً الأخرى لكل نقطة زمنية. عند نقاط توقف مختلفة، سنقوم بغسل مُعدِّلات الإشارات من كل بئر عن طريق تغيير الوسط، ويجب توخي الحذر الشديد عند القيام بذلك لمنع زعزعة الأجسام الجنينية. عند نقاط التوقف الزمنية المختلفة، اغسل المُعدِّلات عن طريق تغيير وسط الـ EB في الآبار. أمل لوحة الـ 96 بئراً بزاوية 10 درجات تقريباً وأزل الوسط من البئر بلطف باستخدام ماصة متعددة القنوات.

بعد ذلك، أضف وسط EB الخالي من المُنظم إلى كل بئر لأي معاملة تزيد مدتها عن 48 ساعة. قم بتغيير وسط EB المضاف إليه مُنظمات جديدة كل يومين حتى وقت التوقف المطلوب. في اليوم السابع بعد تحفيز تكوين الأجسام الجنينية (EBs) عن طريق نقل خلايا ES إلى أطباق ذات 96 بئراً، افحص انكماش الـ EB تحت المجهر.

قم بتصنيف الآبار التي تحتوي على أجسام جنينية (EBS) منقبضة على أنها آبار إيجابية للحصول على النسب المئوية للأجسام الجنينية المنقبضة لكل مسار زمني مختلف للمعالجة. يمكن التحقق من النوافذ الزمنية لإشارات تكوين القلب التي تم تحديدها بواسطة تجارب الطبق ذو الـ 96 بئراً في الأجسام الجنينية المصنعة من القطرات المعلقة لإنتاج قطرات أجسام جنينية معلقة. أولاً، قم بتجهيز أطباق بتري بإضافة ثلاثة إلى أربعة مليليترات من PBS لمنع حدوث تشوه في القطرات لاحقاً.

بعد ذلك، يتم صب معلق من خلايا ES تم تحضيره بكثافة نهائية تبلغ 2.5 × 10⁴ خلية/مل في طبق بكتيري لتسهيل الوصول إليها. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، يتم إضافة قطرات بحجم 20 µL من خلايا ES على الأغطية المقلوبة لأطباق Petri. يجب عدم السماح للقطرات الفردية بملامسة بعضها البعض.

بشكل عام، يمكن للغطاء الواحد أن يستوعب ما يصل إلى 80 قطرة. بعد ذلك، يُقلب الغطاء مرة أخرى فوق طبق بتري المحتوي على PBS ويُحضن لمدة 48 ساعة في حاضنة عند 37 degrees Celsius و5%carbon dioxide للسماح بتكوين الأجسام المضغية (EBs). وبعد مرور 48 ساعة، يتم غسل الأجسام المضغية المتكونة من القطرات المتدلية من كل غطاء باستخدام ثلاثة milliliters من وسط نمو EB.

انقل غطاءين من EBS إلى طبق بتري جديد. قم بحضن طبق بتري لمدة أربعة أيام في حضانة بدرجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide، وفي اليوم الرابع، انقل EBS في حالة تعليق إلى أطباق سداسية الآبار مطلية بـ 0.2% Gelatin بشكل عام. يتم نقل 30 EBS إلى كل بئر، ثم تُحضن المعدلات التأشيرية للمدة الزمنية التي تم تحديدها من تجارب أطباق 96 بئرًا بعد سبعة أيام من تكوين القطرات المعلقة.

افحص الأجسام المضغية (EBS) تحت المجهر للبحث عن انقباضها؛ حيث ستشكل الخلايا الجذعية الجنينية (ES cells) التي نمت في الآبار ذات القاع المستدير في طبق مكون من 96 بئراً أجساماً مضغية (EBS) كما هو موضح في هذه الصورة التمثيلية لجسم مضغٍ (EB) تشكل في اليوم الرابع. وتتمثل النقاط الزمنية الحرجة لتكون الخلايا القلبية من الخلايا الجذعية الجنينية (ES cardiogenesis) في النوافذ الزمنية التي تحتوي على أعلى نسبة من الأجسام المضغية (EBS) المنقبضة والمعالجة بمعدلات الإشارات عند مقارنتها بمجموعة التحكم (vehicle control). يظهر هنا بؤرة من الخلايا القلبية المنقبضة تلقائياً والتي تشكلت من خلايا جذعية جنينية (ES cells) معالجة بالمورفين الظهري في اليوم العاشر من التمايز على طبق معايرة دقيقة مكون من 96 بئراً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية التحديد الفعال للتنظيم الزمني الحرج، ونوافذ مسارات الإشارات الرئيسية في تكوين القلب من الخلايا الجذعية الجنينية (ES cardiogenesis).