عالية الإنتاجية قياس وتصنيف ف العضوية في العينات البيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيف الفسفور العضوي المتحلل إنزيمياً في مستخلصات عينات التربة أو السماد. ويتم تحقيق ذلك من خلال استخلاص العينات أولاً بمحلول EDTA هيدروكسيد الصوديوم وضبط الرقم الهيدروجيني (pH) للمستخلصات، ثم تحضين هذه المستخلصات المعدلة مع محلولين إنزيميين مختلفين.

في لوحة ذات 96 بئراً، تتمثل الخطوة النهائية في قياس الأورثوفوسفات المتحرر بفعل الإنزيم باستخدام قياس اللون الأزرق للموليبدنيوم. وفي نهاية المطاف، يمكن تصنيف معظم أشكال فوسفور أحادي إستر الأورثوفوسفات وفوسفور ثنائي الإستر الأصلية في عينات التربة أو السماد بناءً على التحرر التفاضلي للأورثوفوسفات بواسطة طريقة التحلل المائي الإنزيمي. ويمكن تنفيذ هذه الطريقة بتكلفة منخفضة في أي مختبر قياسي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الحالية، مثل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للفوسفور 31، في قدرتها على قياس إمكانيات إنزيمات التربة الأصلية لتحرير الأورثوفوسفات من مركبات البازلاء العضوية في المستقبل. وبناءً على ذلك، يمكن للبيانات التي يتم الحصول عليها بهذه الطريقة أن تساعد في التنبؤ بخصوبة التربة أو احتمالية تحرير التربة لكميات ضارة من الأورثوفوسفات المتاح للطحالب. أضف 30 milliliters من محلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.25 molar إلى جرامين من العينة الرطبة أو المجففة في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliters.

يتم التحضين مع الرج لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تُطرد العينات مركزياً بسرعة 3000 ×g لمدة 30 دقيقة، ثم يتم نقل 100 µL إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL يحتوي مسبقاً على منظم الأسيتات. يبلغ الحجم الإجمالي للعينة المعدلة 1 mL وبقيمة pH تبلغ 5.0.

قم بتحضير محلولين مركزين يحتوي كل منهما على 0.5 وحدة لكل ملليلتر من إنزيم الفوسفاتيز الحمضي (acid phosphatase) في 10 ملليلتر من محلول خلات الصوديوم بتركيز 0.1 مولار ورقم هيدروجيني pH 5 المحضر حديثاً. الآن، أضف إنزيم النوكلييز NP1 المجفف بالتجميد والمُعاد تشكيله والمستخلص من *Penicillium Citron* إلى أحد أنابيب الـ 10 ملليلتر من مخزونات الفوسفاتيز الحمضي للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2.5 وحدة من NP1 لكل ملليلتر، مع الخلط برفق عن طريق القلب لعدة مرات، ثم قم بطرد مركزي لمحلولي الإنزيم عند 3000 ×g لمدة 30 دقيقة. ومن أجل إنشاء منحنى معايرة، ابدأ بإضافة 1 ملليلتر من المحلول المركز لفوسفات البوتاسيوم بتركيز 1 ملليمولار إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر، وقم بإجراء سبعة تخفيفات متسلسلة بمقدار 0.5 ملليلتر، مع التخلص من الأنبوب الأول بحيث يتراوح نطاق التخفيف النهائي من 20 µM إلى 0.625 nM من الفسفور.

قم الآن بنقل معايير الـ ORTHOPHOSPHATE إلى العمودين الأخيرين في اللوحة، بدءاً من صفر NM من الـ orthophosphate في الصف A وصولاً إلى 20 nm من الـ orthophosphate في الصف H في الآبار الثلاثة الأولى من العمود 10. أضف 40 µL من محلول إنزيم PP plus GP إلى الآبار الثلاثة التالية من العمود 10. أضف 40 µL من محلول إنزيم PP plus GP plus NP one.

أخيراً، أضف 40 µL من محلول acetate buffer بتركيز 100 mM إلى جميع الآبار الستة. الآن يجب أن يحتوي كل بئر من الآبار الستة الأولى في العمود 10 على 80 µL من المحلول بالنسبة للبئرَين التاليين. أضف 40 µL من محلول sodium acetate الذي يحتوي على 10 M glucose وsix phosphate، و40 µL من محلول إنزيم PP plus GP.

لكل عينة يتم اختبارها، وزع 40 µL من مستخلصات العينات المعدلة القيمة الهيدروجينية (pH) في الآبار من واحد إلى تسعة في ما يصل إلى ثمانية صفوف بعد توزيع جميع العينات. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع محلول إنزيم PP plus GP في الأعمدة من واحد إلى ثلاثة، ومحلول PP plus GP plus NP 1 في الأعمدة من أربعة إلى ستة، ومحلول منظم أسيتات الصوديوم بتركيز 0.1 molar في الأعمدة من سبعة إلى تسعة. نفذ هذه الخطوة بسرعة لضمان حصول جميع العينات على وقت تحضين متكافئ.

قم بتغطية الطبق ذي الـ 96 بئراً بغطاء، ثم قم بحضن العينات ومحاليل الإنزيمات وعينات الضبط ومنحنى المعايرة لمدة ساعة واحدة بالضبط عند 37 درجة مئوية في ماء منزوع الأيونات. قم بتحضير 50 milliliters من كل من المحاليل المخزونية الأربعة. يجب تحضير المحلول A يومياً وباستخدام ماصة متعددة القنوات وبسرعة.

أضف 25 µL من SDS و 100 µL من المحلول a و 20 µL من المحلول B و 50 µL من المحلول C إلى جميع آبار لوحة الـ 96 بئر، ثم غطِّ اللوحة واتركها لتحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، قم بقياس الامتصاصية عند 850 nm باستخدام أي قارئ للألواح الدقيقة القابل للضبط وتطبيق جداول بيانات.

أولاً، قم برسم منحنى معايرة الفسفور غير العضوي بحيث يكون المحور السيني (x) من 0 إلى 20 nanomoles phosphorus، والمحور الصادي (Y) هو متوسط قياسات الامتصاص المكررة، ثم أجرِ انحداراً خطياً لاستخراج معادلة خط أفضل مطابقة. بعد ذلك، احسب قيمة الفسفور غير العضوي في الخلفية عن طريق حساب متوسط القيم في الأعمدة من واحد إلى ثلاثة، ثم تطبيق منحنى المعايرة على مجموعة البيانات. ولتحديد الفسفور المشتق من أحاديات إستر الفسفور المتحللة مائياً، قم بحساب متوسط قيم العينات الثلاثية من الأعمدة أربعة إلى ستة، ثم اطرح منها قيمة محلول الإنزيم الضابط بالإضافة إلى الفسفور غير العضوي في الخلفية.

بعد ذلك، ولحساب محتوى الفسفور من الفسفور المتحلل مائياً، تقوم DERs بحساب متوسط قيم العينات المكررة ثلاث مرات من العمود السابع إلى التاسع، وطرح محلول الإنزيم الضابط بالإضافة إلى الفسفور غير العضوي الخلفي بالإضافة إلى فسفور أحادي الإستر المتحلل مائياً من الأعمدة الرابعة إلى السادسة. تُظهر لوحة 96 بئراً نموذجية نتائج ثماني عينات ومنحنى معايرة. وتوجد الضوابط في العمود 10.

تعود زيادة كثافة اللون بين العمودين الأول والثالث، ومن الرابع إلى السادس، إلى مركبات الفسفور أحادية الإستر المتحللة مائيًا؛ بينما تعود الزيادة بين العمودين الرابع والسادس، ومن السابع إلى التاسع، إلى مركبات الفسفور ثنائية الإستر المتحللة مائيًا. تم هنا استخدام طريقة التحلل المائي الإنزيمي عالي الإنتاجية لتحليل توزيع فئات الفسفور بنجاح في مستخلصات عينة تربة من فيرمونت باستخدام هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.25 molar وEDTA بتركيز 0.05 molar. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الأرثوفوسفات الأصلي، ومركبات الفسفور أحادية الإستر، وثنائية الإستر في مستخلصات التربة أو السماد باستخدام التحلل المائي الإنزيمي.

قد تساعد هذه التقنية في تمهيد الطريق للباحثين في مجالات الكيمياء البيئية وإدارة المغذيات لاستكشاف سلوك P العضوي في أنظمة التربة أو السماد العضوي.