تميز باستخدام مواد متطايرة الجرثومي الثانوي قداس الطيف Electrospray التأين (سيسي - MS)

يتيح التأين بالترذيذ الإلكتروني الثانوي، ومطيافية الكتلة، أو CS EMS تحليل المواد البكتيرية المتطايرة دون الحاجة إلى أي معالجة مسبقة للعينة. يتم إزاحة الحيز الرأسي للمزرعة البكتيرية بواسطة ثاني أكسيد الكربون إلى غرفة تفاعل cssi. وبينما تعبر المواد المتطايرة غرفة تفاعل SSI، فإنها تمر عبر سحابة الترذيذ الإلكتروني وتصبح متأينة.

بمجرد تأين المواد المتطايرة، تُسحب إلى مطياف الكتلة لتحليلها. يتم تمرير الغاز الحامل الزائد والمواد البكتيرية المتطايرة غير التفاعلية عبر مرشح بمسامية 0.22 micron لإزالة أي عوامل بكتيرية كإجراء وقائي إضافي، ثم تُطرد إلى خزانة استخلاص كيميائية. وفي النهاية، يتيح بروتوكول CSI MS هذا الحصول على بصمات المواد البكتيرية المتطايرة في غضون دقائق.

نتوقع إمكانية استخدام هذه التقنية في تطبيقات متعددة، بما في ذلك تحليل زفير الأنفاس للكشف عن الأمراض المعدية، أو حتى تطبيقها على الأنظمة الغذائية حيث قد نتمكن من الكشف السريع عن المسببات المرضية الموجودة على أغذيتنا أو فيها. وتتميز هذه التقنية بعدة مزايا رئيسية مقارنة بالطرق الحالية مثل GCMS و sift-MS و PT-RMS؛ وأولها أن المواد المتطايرة لا تتطلب أي معالجة مسبقة قبل التحليل.

ثانياً، يمكن تكسير أيونات محددة في الخليط المتطاير، مما يسهل عملية تحديد المركبات. وثالثاً، تتسم هذه الطريقة بالسرعة، حيث تستغرق عادةً أقل من خمس دقائق.

لتحليل كل عينة، اختر الوعاء المناسب لاستزراع المستنبت، مع مراعاة متطلبات نمو النوع، بالإضافة إلى ضمان التوصيل الفعال للمواد المتطايرة إلى مطياف الكتلة. في هذا العرض التوضيحي، اخترنا زجاجات أوساط بيركس قياسية سعة 100 milliliter. يتم نقل المواد المتطايرة البكتيرية إلى مطياف الكتلة بواسطة تيار من الغاز الحامل لتجميع الحامل.

قم بتركيب خطوط الغاز في زجاجات المزرعة ذات الأغطية الملولبة التي تحتوي على منفذي لوك (lure ports) على الأقل. أدخل خطوط مدخل ومخرج الغاز عبر منافذ اللوك، وسد أي منافذ إضافية قبل البدء في زراعة العينات. قم بضغط الأوعية وغمرها في الماء للتحقق من عدم وجود تسريبات.

تعد تسريبات الغاز سبباً رئيسياً للنتائج غير النمطية التي تظهر في شكل إشارات أيونية متطايرة ضعيفة أو غائبة تزداد خلال الليل. مزارع من *E. coli* K12 و *Pseudomonas aerogenes* PAO1 في وسط LB Lennox، مع تحضير مكررين بيولوجيين لكل نوع.

قم بتحضير تسع زجاجات مزارع معقمة تحتوي كل منها على 50 milliliters من LB Lennox، وزجاجة واحدة غير ملقحة لاستخدامها كعينة فارغة (blank). قم بتلقيح كل مزارع ليلة كاملة في زجاجتين من زجاجات العينات لإنشاء مكررات تقنية. حضّن المزارع والعينة الفارغة لمدة 24 ساعة عند 37 °C. ونظراً لأن نظام CEMS مصمم خصيصاً لأخذ عينات من المواد المتطايرة، يجب الحد من استخدام منتجات العناية الشخصية العطرية قبل استخدام الجهاز بإحكام.

أغلق جميع المواد الكيميائية المتطايرة في المختبر وتحكم في تيارات الهواء قدر الإمكان أثناء الاختبار لمنع تلوث جهازك وخطوط نقل الغاز. وفي حالة استخدام عوامل بيولوجية حيوية، قم بتركيب مرشحات ذات حجم مسام مناسب في خط الغاز الحامل. لن تعيق هذه المرشحات انتقال المواد المتطايرة إلى غرفة تفاعل sesi، ولكن قد تؤثر بشكل طفيف على كفاءة انتقال الهباء الجوي.

من أجل التحقق من إيقاف تشغيل مصدر الجهد وتفريغ النظام من الكهرباء، افحص مصابيح المؤشر الموجودة على مزود الجهد للتأكد من إيقاف تشغيله. تأكد من أن الجهد على الملتيميتر هو zero وقم بتأريض الأسلاك الكهربائية. في هذه المرحلة، قم بتثبيت محلول الرش الكهربائي للتحليل.

في وضع الأيونات الموجبة، نستخدم محلول رش كهربائي يتكون من 0.1% حمض الفورميك، و5% ميثانول، و94.9% ماء. ولتحقيق أقصى قدر من شدة واستقرار الإشارة، قم بتشغيل غاز ثاني أكسيد الكربون الحامل واضبط معدل التدفق على لترين في الدقيقة. قم بتطبيق الضغط على خزان الرش الكهربائي لبدء إيصال محلول الرش الكهربائي إلى غرفة التفاعل بمعدل تدفق قدره خمسة نانولتر في الثانية. بعد ذلك، قم بتشغيل مصدر الجهد واضبط الجهد على 2.5 كيلوفولت.

يؤثر الجهد الكهربائي المطبق على شدة أيونات الإشارة واستقرار مخروط الرش الكهربائي، وبالنسبة لجهود نظامنا، فإن القيم التي تتراوح بين 2 و 5 kilovolts تعطي أفضل النتائج في وضع الأيونات الموجبة. يجب توخي الحذر في هذه المرحلة لأن الأسطح المعدنية لمصدر التأين يمكن أن تسبب صدمة كهربائية خطيرة. الآن، قم بإعداد طريقة الضبط لمراقبة طيف SEMS.

قم بإلغاء تحديد مربع اختيار اكتساب القنوات المتعددة (MCA). اضبط وقت الاكتساب على 10 إلى 15 دقيقة وابدأ في اكتساب البيانات. راقب أطياف خلفية الغاز الحامل وقم بإجراء تعديلات دقيقة على الجهد المطبق للحصول على كروماتوغرام أيوني كلي مستقر ومسوحات قابلة للتكرار.

استمر في جمع الأطياف وTIC لمدة خمس دقائق لضمان استقرار الجهاز مع التأكد من سلامته. أدخل معاملات الاستحواذ المناسبة لتجربتك. سجل طيف الخلفية لغاز الحامل لاستخدامه في التجارب المستقبلية.

لجمع طيف فارغ (blank Spectrum)، وجه تدفق الغاز الحامل عبر خطوط التجاوز، ثم قم بتوصيل العينة الفارغة، مع إبقاء الصمامات مغلقة، بخطوط النقل الخاصة بالجهاز. افتح الصمامات المؤدية إلى زجاجة العينة وأغلق صمامات خطوط التجاوز.

للحصول على أطياف قابلة للتكرار، اترك النظام ليصل إلى حالة التوازن لمدة 30 ثانية، وهي الفترة التي تستقر خلالها الرطوبة في غرفة التفاعل. وللتأكد من وصول النظام إلى حالة التوازن، راقب TIC، والذي سيتغير خلال فترة التوازن ثم يليه الاستقرار.

بمجرد وصول النظام إلى حالة التوازن، ابدأ في جمع الطيف. وبعد الانتهاء من جمع الطيف، قم بإزالة زجاجة العينة عن طريق فتح خطوط تجاوز غاز النقل أولاً، ثم إغلاق صمامات العينة.

وأخيرًا، يتم إزالة زجاجة العينة. يُشطف النظام باستخدام الغاز الحامل لمدة تتراوح من دقيقتين إلى أربع دقائق لإزالة الرطوبة والمواد المتطايرة الممتصة من خطوط النقل ومنع انتقال الملوثات من عينة إلى أخرى. يتم جمع بيانات بصمة المواد المتطيرة لكل عينة بكتيرية مع جمع أطياف فارغة إضافية بشكل متقطع لضمان طرح دقيق للخلفية.

تعتبر البصمات المتطايرة في وضع الأيونات الموجبة لبكتيريا e coli وبكتيريا p aerogen، التي نمت هوائيًا في وسط LB Lennox لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، متمايزة. يطغى على طيف المتطايرات لبكتيريا e coli مركب indu عند نسبة الكتلة إلى الشحنة 118، بينما يحتوي طيف Pseudomonas aerogen على مجموعة متنوعة أكبر من القمم القابلة للإضافة البروتينية.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تقوم بتسجيل بارامترات الجهاز التي قمت بتحسينها لتحليلك، مثل الجهد المطبق، وتركيب محلول الرش الكهربائي، ومعدل تدفق الغاز الحامل. ومن المهم أيضاً أن تحتفظ بسجلات لأطيافك التمثيلية حتى تتمكن من إعادة إنتاج تحليلاتك في المستقبل. ولا تنسَ أن العمل مع البكتيريا الممرضة والجهد العالي قد يكون شديد الخطورة.

لذلك، يجب دائمًا اتخاذ احتياطات مثل تقييد الوصول إلى css CMS أثناء التجربة. الآن، يجب أن تكون قادرًا على الحصول بشكل قابل للتكرار على أطياف CSS و EMS للمركبات البكتيرية المتطايرة في نظامك. بالتوفيق.