توصيف المعزولة ، مهواة ، والرئة ماوس المجهزة Perfused مع تدفق نابض

لدراسة علاقات تدفق الضغط الرئوي النابض. يوضح هذا البروتوكول كيفية عزل الرئتين لدى الفأر وتهويتهما وترويتهما. يتم كشف الرغامى جراحيًا لإتمام عملية التهوية.

بعد ذلك، يتم عزل القلب والرئتين لتمكين تركيب القنيات في الشريان الرئوي والأذين الأيسر. ثم يتم تروية الجهاز الرئوي. وتُجرى التجارب عن طريق تغيير تدفق الشريان الرئوي من حيث المقدار، أو شكل الموجة، و/أو التردد.

يتم تسجيل أشكال موجات ضغط الشريان الرئوي والأذين الأيسر الناتجة، والتي توضح علاقات تدفق الضغط الرئوي النبضي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التحضيرات الحية (in vivo)، في إمكانية الحصول على علاقات تدفق الضغط النبضي دون حدوث تغييرات في حالة الحجم، أو نغمة الجهاز العصبي الودي، أو النشاط، أو تأثيرات التخدير.

علاوة على ذلك، تقيس معظم تحضيرات الرئة المعزولة علاقات تدفق الضغط الثابت فقط، بينما تسمح تقنيتنا بتحديد علاقات تدفق الضغط النبضي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الفسيولوجيا الرئوية، مثل كيف يؤثر مرض الأوعية الدموية الرئوية على الديناميكا الدموية الرئوية النبضية، أو كيف يؤثر تصلب الشريان الرئوي الكبير على الحمل البعدي للبطين الأيمن؟ يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية لأن كشف القلب والرئتين وتثبيت القُنَيّة في الشريان الرئوي يُعد أمرًا صعب التعلم.

يمكن أن يتسبب الضغط الزائد الناتج عن الأجهزة في حدوث وذمة رئوية، كما يمكن أن يؤدي الوضع غير الصحيح للقنية إلى ثقب الشريان الرئوي. قبل البدء في التجربة، من الضروري تحضير نظام IL one المستخدم لتهوية وتروية الرئة المعزولة. يجب توصيل الأنابيب بمحولات طاقة الضغط.

باستخدام مضخة واحدة ومقياس تدفق، قم بغسل النظام بالكامل بماء مقطر مسخن إلى 37 degrees Celsius وأزل أي فقاعات موجودة في الأنابيب. بعد ذلك، قم بتحضير أنابيب مضخة Endur tech باستخدام 1%PBS. ثم قم بضبط نقطة الصفر.

يتم قياس الضغط لكل محول طاقة P 75 أولاً عن طريق إغلاق صمام الجهاز المتصل بنظام IL وفتح صمامه المتصل بالغلاف الجوي. ثم استخدم مضخم SIS السدادي لتصفير الضغط تلقائياً قبل تحضير الحيوان؛ قم بترطيب إعداد IO one عن طريق نقع القطعة الخزفية المسامية في ماء مقطر. بعد تخدير الفأر، يتم تثبيت الفأر للجراحة عن طريق تثبيت قوائمه الأمامية على لوح من الفلين.

قم الآن برش منطقة الصدر بـ 95%alcohol. استخدم ملقطاً مستقيماً للإمساك بالجلد عند الرقبة، ثم اصنع فتحة بطول 1 cm باستخدام مقص مستقيم. وبمجرد انكشاف الجزء الداخلي من الرقبة، قم باستئصال الأنسجة الغدية البيضاء الموجودة في العضلات السطحية أثناء البحث عن المريء والقصبة الهوائية.

اعزل المريء والرغامى عن الأنسجة الموجودة على كلا الجانبين ومن الجهة الخلفية، ثم اربط غرزة رخوة حول الرغامى. ولتركيب القثطرة في الرغامى، قص فتحة صغيرة على شكل حرف V بحذر في أحد جانبيها باستخدام المقص الصغير. الآن، انقل الفأر إلى نظام IL one باستخدام ملقط غير مدبب.

أمسك بالكنولة الرغامية وقم بتمريرها داخل الرغامة. ثبت الكنولة باستخدام غرزة جراحية. ابدأ عملية التهوية باستخدام هواء الغرفة أولاً، ثم رش الصدر بالكحول وأزل الجلد باستخدام ملاقط مستقيمة ومقص مستقيم.

اقطع الجلد للأعلى على طول عظمة القص. ارفع الجلد على كل جانب واقطع على طول خط الأضلاع السفلية. الآن، أمسك بالنتوء الخنجري باستخدام ملقط، واستخدم مقصاً ذا طرف كروي لعمل فتحة في الحجاب الحاجز عند نقطة التقائه بأسفل عظمة القص.

أمسك بالحجاب الحاجز وافصله عن الأضلاع. باستخدام مقص ذي رؤوس كروية، أمسك بالنتوء الخنجري مجدداً واستخدم المقص لقص عظمة القص بعناية صعوداً عبر الأضلاع دون إتلاف الرئتين أو القلب أو الأوعية الدموية. ولكشف القلب، أمسك بالأضلاع اليسرى واقطع أطرافها.

الآن، قم بحقن البطين الأيمن ببطء بـ 0.1 milliliters من heparin. بعد الحقن، قم بقص بقية الأضلاع. استخدم الطرف الخلفي أو المستدير من الملقط لدفع الرئتين برفق بعيدًا عن الضلع أثناء قص الأضلاع تحت المجهر. قم بإزالة الأنسجة الغدية الموجودة في الدهون فوق القلب.

استخدم الملاقط لإبعاد الأنسجة ثم قم بتقليمها. وباستخدام مقص الزنبرك، ضع غرزة جراحية حول الأبهر والشريان الرئوي، مع رفع القلب برفق باستخدام ملاقط غير حادة. يجب أن تكون المقاومة ضئيلة.

الآن، قم بربط غرزة رخوة باستخدام العقدة المزدوجة. بعد ذلك، استأصل الجزء السفلي من البطن. استخدم مقصاً بزاوية للقص نزولاً عبر الأضلاع والعمود الفقري.

سيؤدي ذلك إلى تدفق كمية كبيرة من الدم. استخدم مسحة قطنية لوقف التدفق. وبمجرد توقف تدفق الدم، قم بتجهيز نظام IL باستخدام 4 mL من RPMI من سرنجة مملوءة بـ 10 mL من RPMI.

من الجيد التأكد مرة أخرى من خلو الأنابيب من الفقاعات. الآن، قم بقسطرة البطين الأيمن عن طريق عمل شق صغير بالقرب من القمة وإدخال القسطرة. وجه القسطرة للأسفل داخل البطين الأيمن للوصول إلى الشريان الرئوي. يجب أن تكون طرف المسبار مرئياً من خلال الجدار الشفاف تقريباً للشريان الرئوي.

ثم أحكم ربط الغرزة حول القنية والشريان الأورطي والشريان الرئوي لتركيب القنية في البطين الأيسر. اصنع شقاً صغيراً في القمة وأدخل القنية متجهاً للأعلى نحو الأذين الأيسر. قد يلزم تطبيق ضغط خفيف لتحديد موقع الصمام، ولكن بمجرد العثور عليه، ستنزلق القنية من خلاله وتستقر في مكانها دون الحاجة إلى غرزة.

قم بحقن RPMI يدويًا من سرنجة سعة 10 milliliter بمعدل 0.3 milliliters في الدقيقة حتى يظهر التدفق في أنبوب التصريف. وفي حال عدم وجود تدفق في أنبوب التصريف، قم بإعادة وضع كانيولا البطين الأيسر. أما إذا لم يكن هناك تدفق في الرئتين، فيجب إيقاف التجربة لأن الشريان الرئوي قد يكون به تسريب.

بعد إتمام عملية قثطرة القلب بالكامل، قم بتوصيل حقنة سعة 60 مل بنظام IL one. وباستخدام مضخة التدفق الثابت، قم بتسريب RPMI Perfuse eight بمعدل 1 مل لكل دقيقة. تحقق من عدم وجود تسريب أثناء عملية التروية الأولية.

قم بتروية الرئتين تدريجياً لمدة دقيقتين إضافيتين، حيث سيتغير لون الرئتين إلى اللون الأبيض خلال هذه الفترة. بالنسبة لدراسات التدفق النبضي، قم أولاً بضبط إزاحة مكبس المضخة المنفردة عند المستويات المطلوبة.

بعد ذلك، قم بضبط معدل التدفق الثابت. الآن افتح الصمام المؤدي إلى مضخة osli وابدأ في تسجيل البيانات مباشرة قبل تشغيل ملف تدفق osli. وبمجرد الانتهاء، افتح ملف مخرجات البيانات وقم برسم التدفق التجريبي بناءً على التدفقات التجريبية من التجربة الأولية.

اضبط إزاحة مكبس المضخة التذبذبية عند كل تردد بحيث تكون Q max وفقاً للمستوى المطلوب. حافظ على التهوية عند ضغط ثابت. أثناء جمع البيانات لتجارب التدفق المستقر، أغلق الصمام المؤدي إلى المضخة المنفردة واضبط معدل التدفق المستقر على المستوى المطلوب. ابدأ في تسجيل البيانات واتبع خطوات بروتوكول التدفق المستقر.

جمع البيانات لمدة 10 ثوانٍ على الأقل عند كل معدل تدفق بين التجارب. إعادة ضبط معدل التدفق إلى 0.5 milliliters per minute. تأكد من الحفاظ على التهوية عند ضغط ثابت أثناء جمع البيانات.

إذا كانت التجارب تتطلب ضغطاً صفرياً في الأذين الأيسر، فقم بإزالة أنابيب التدفق أثناء إجراء التجارب. راقب بدقة وصول وسط RPMI إلى أنابيب المجرى التنفسي؛ إذ يجب عدم السماح لوسط RPMI بالوصول إلى محولات ضغط المجرى التنفسي لتجنب تلفها.

فيما يلي نتائج التروية ذات التدفق الثابت مع تدفق Q في الصف العلوي، وضغوط الشريان الرئوي والأذين الأيسر الناتجة في الصف الثاني تحت ظروف متنوعة. في اللوحتين الأوليين، ارتفع ضغط الأذين الأيسر وانخفض مع Q لأن أنابيب التدفق كانت في مكانها؛ حيث توضح اللوحة الأولى ضغط الهواء في نهاية الشهيق، وتوضح اللوحة الثانية ضغط الهواء في نهاية الزفير. بعد ذلك، تمت إزالة الأنابيب بحيث أصبح ضغط الأذين الأيسر ثابتاً ومستقلاً عن Q. ثم تم ضبط ارتفاع أنبوب المخرج يدوياً بحيث أصبح ضغط الأذين الأيسر أعلى.

ولكن بصرف النظر عن Q مرة أخرى، تُظهر اللوحة الأولى ضغط الهواء في نهاية الشهيق، وضغط الشهيق، وتُظهر الثانية ضغط الهواء في نهاية الزفير. ويمكن الحصول على علاقات تدفق ضغط الشريان الرئوي المستقرة الناتجة لكل حالة عن طريق رسم الضغط مقابل التدفق.

تظهر هنا نتائج تروية التدفق النبضي مع التدفق Q في اللوحة العلوية، والضغوط الناتجة في الشريان الرئوي والأذين الأيسر والهواء في اللوحة السفلية. ومن خلال علاقات تدفق الضغط الرئوي النبضي هذه، يمكن حساب الممانعة الوعائية الرئوية، والتي تعكس إجمالي الحمل البعدي للبطين الأيمن.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 20 إلى 30 دقيقة. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم التمهل والاسترخاء لضمان ثبات اليدين. وبمجرد تروية الرئتين بشكل كافٍ، يكون الجزء الأصعب قد انتهى.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل الدراسات النسيجية أو المقاييس البيوكيميائية على أنسجة الرئة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل الآليات الجزيئية المسؤولة عن التغيرات الملحوظة في علاقات تدفق الضغط النابض الرئوي. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفسيولوجيا الرئوية لاستكشاف دور جينات وبروتينات محددة في تطور وتفاقم أمراض الأوعية الدموية الرئوية باستخدام الفئران المعدلة وراثياً.