سبع خطوات لخلايا النجمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا النجمية الكبدية من كبد الفأر. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء تروية لكبد الفأر باستخدام الإنزيمات الهاضمة في الموقع. وبعد التروية، يتم تقطيع الأكباد إلى قطع صغيرة لزيادة كفاءة الهضم في المختبر، والذي يتم إجراؤه في الخطوة التالية.

كخطوة نهائية، يتم فصل الخلايا النجمية الكبدية عن أنواع خلايا الكبد الأخرى باستخدام طرد مركزي بتدرج الكثافة. وفي النهاية، يتم الحصول على الخلايا النجمية الكبدية ويمكن تقييم نقاوها باستخدام المجهر الضوئي ومجهر التألق المناعي. سيقوم باتريك ماير، وهو طالب دراسات عليا من المختبر، بشرح الإجراء. وتحضيراً لعملية تروية NC two لأكباد الفئران، قم أولاً بتدفئة محلول SC one المنظم ومحاليل تروية الإنزيم في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C.

بعد ذلك، قم بضبط المضخة 연동ية (peristaltic pump) للحصول على تدفق صفائحي بمعدل 6.5 milliliters per minute ووازن أنبوب السيليكون الخاص بالمضخة باستخدام محلول SC one. الآن، تأكد من وصول الفأر المخدر إلى حالة تخدير عميق عن طريق فحص فقدان المنعكسات. ثم قم بتثبيت الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري على قاعدة مناسبة.

استخدم المقص والملاقط لإجراء شق طولي في جلد البطن وكشف البريتون. افتح البريتون بعناية وحرك الأمعاء خارج تجويف البطن إلى الجانب الأيسر من الحيوان من أجل كشف الوريد البابي. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو تروية الكبد بالإنزيمات الهاضمة، وهو ما سيتم توضيحه.

بعد ذلك، من المهم استخدام مجهر ستيريو عند إدخال الكانيولا ومراقبة التغيرات في تراكيب الكبد بدقة أثناء عملية التروية. أثناء العمل تحت مجهر ستيريو، أدخل كانيولا مجموعة التسريب في الوريد البابي. ابدأ تروية الكبد باستخدام 30 milliliters من محلول SC one. افتح الوريد الأجوف السفلي مباشرة بعد بدء التدفق.

يُستدل على نجاح عملية غسيل الكبد من خلال فقدان لون أنسجة الكبد، بعد ذلك، يتم تروية الكبد بـ 30 milliliters من محلول Pronase E. ستنتفخ فصوص الكبد وستظهر الفصيصات متميزة من خلال الكبسولة بعد التروية بمحلول pronase E المتبوع بتروية بـ 30 milliliters من محلول collagenase P. عند اكتمال التروية بـ collagenase P، يتم استئصال الكبد من الفأر عن طريق تشريحه بعناية من الحجاب الحاجز والأعضاء المحيطة، وتخزينه في 70 milliliters من محلول SC two على الثلج.

يكون الكبد في هذه المرحلة قد فقد شكله وبدا رخواً وغير متبلور. يجب إجراء عملية هضم أكباد الفئران تحت ظروف معقمة، وذلك داخل خزانة تدفق هوائي صفائحي.

استخدم مقصاً حاداً لتقطيع الكبد إلى قطع يبلغ حجمها حوالي 2×2×2 مليمتر مكعب. بعد ذلك، اخلط معلق 70 مليليتر من SC two وقطع الكبد مع 50 مليليتر من محلول protease E collagenase P. أضف 1 مليليتر من dna, one solution واهضم الكبد لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التحريك.

بعد الهضم الإنزيمي لأنسجة الكبد، يتم فصل الخلايا النجمية عن أنواع الخلايا الكبدية الأخرى عن طريق طرد مركزي بتدرج الكثافة. لبدء هذا الإجراء، قم بترشيح معلق الخلايا عبر مصافي خلايا بقطر 70 micrometer في ستة أنابيب فالكون سعة 50 milliliter، واغسل الخلايا باستخدام محلول E two المنظم، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 minutes عند 600 Gs ودرجة حرارة 4 °C. بعد الطرد المركزي، اسحب بعناية 40 milliliters من الرائق من كل أنبوب.

ثم أضف 150 µL من محلول DNA's one إلى كل أنبوب وأعد تعليق الخلايا. اجمع معلقات الخلايا في أربعة أنابيب Falcon سعة 50 mL واغسلها باستخدام G-B-S-S-P بواسطة جهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 600 ×g ودرجة حرارة 4 °C. اسحب أكبر قدر ممكن من السائل الطافي بعناية دون تحريك الراسب، ثم أضف 150 µL من محلول DNAs one إلى كل أنبوب.

نقوم بتعليق كتل الخلايا في 10 milliliters من G-B-S-S-B لكل أنبوب. تُجمع الخلايا في أنبوبي فالكون سعة 50 milliliter، ويُضاف G-B-S-S-B ليصل الحجم الإجمالي إلى 36 milliliters لكل أنبوب. يُضاف 14 milliliters من محلول den إلى كل أنبوب مع الخلط جيداً.

بعد ذلك، انقل 10 milliliters من معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي متدرج سعة 12 milliliter، ليصبح المجموع 10 أنابيب. أضف بلطف 1.5 milliliters من G-B-S-S-B فوق معلق الخلايا في كل أنبوب. قم بطرد التدرجات مركزياً لمدة 15 minutes بسرعة 1500 Gs وعند درجة حرارة 4 °C بدون توقف.

بعد ذلك، ستتجمع الخلايا الكبدية في شكل قرص في قاع الأنبوب، بينما توجد الخلايا النجمية في الطبقة البينية على شكل حلقة بيضاء. باستخدام ماصة سعة 5 milliliter، اسحب بعناية الطبقة البينية التي تحتوي على الخلايا النجمية وانقلها إلى أنبوب سعة 50 milliliter. اغسل الخلايا بإضافة G-B-S-S-B ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 minutes عند 600 Gs ودرجة حرارة 4 °C.

قم بشفط السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 20 milliliters من وسط DMEM مع المكملات. بعد عد الخلايا، انقلها إلى دوارق زراعة الأنسجة بتركيز 2 × 10⁴ خلية لكل سنتيمتر مربع، ثم حضّن الخلايا عند 37 °C و 5% carbon dioxide. بعد حوالي ساعتين من تحضيرها، يجب أن تكون الخلايا النجمية الكبدية ملتصقة، قم بتغيير الوسط لغسل الخلايا الميتة وبقايا الخلايا.

أعد الخلايا إلى الحاضنة؛ تظهر هنا النتائج التمثيلية لتحضير الخلايا النجمية الكبدية من أكباد الفئران باستخدام هذا البروتوكول. تظهر الخلايا في اليوم الأول واليوم الثالث من الزراعة المخبرية المورفولوجيا المميزة للخلايا النجمية الكبدية، حيث تكون ذات شكل نجمي وتظهر تخزيناً للحويصلات الدهنية.

في المواقع النووية، يمكن أيضاً التحقق من نقاء الخلايا النجمية الكبدية المعزولة عن طريق تعبير البروتين الحمضي الليفي الدبقي أو GFAP. تُظهر هذه الصور صبغاً مناعياً فلورياً نموذجياً لـ GFAP موضحاً باللون الأحمر في الخلايا النجمية الكبدية، والتي تم استزراعها لمدة ثلاثة أيام بعد عزل الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا النجمية الكبدية من كبد العصبون للحصول على إنتاجية كافية من الخلايا النجمية النقية.

من المهم ضمان الهضم الفعال عند تروية الكبد. وأخيرًا، من الضروري تحديد الكيان الصحيح للخلايا المعزولة من خلال تقييم المورفولوجيا والنمط الظاهري لخلايا الكبد.