إسقاط خلية بسيطة الشنق بروتوكول الثقافة للجيل 3D الأجسام الشبه الكروية

الهدف من هذه التجربة هو توليد تراكيب شبيهة بالأنسجة ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك من خلال حصاد الخلايا المستنبتة أولاً، ثم توليد معلق خلوي أحادي. بعد ذلك، يتم ترسيب قطرات من المعلق الخلوي على الجانب السفلي من الغطاء المقلوب لطبق استنبات الأنسجة.

بعد ذلك، يتم قلب الغطاء فوق غرفة الترطيب. وتتمثل الخطوة الأخيرة في تحضين القطرات المعلقة لمدة 24 إلى 48 ساعة للسماح بتكوين التجمعات. ويمكن بعد ذلك نقل هذه التجمعات إلى حمام مائي هزاز وتحضينها لمدة تصل إلى خمسة أيام إضافية.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر اختلافات في تماسك التجمعات الخلوية أو فرز الخلايا من خلال مقايسات الانضغاط، أو تماثل سطح النسيج، أو مجهر الفلورة فوق البنفسجية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل زراعة الأنسجة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) على سبيل المثال، في أن الخلايا التي تنمو في بيئة ثلاثية الأبعاد (3D) تحاكي بشكل أوثق التفاعلات الخلوية التي تمر بها الخلايا في بيئة النسيج. سأقوم بتوضيح هذه الطريقة لأبين لكم أنها بسيطة للغاية لدرجة أن الباحث الرئيسي (PI) يمكنه القيام بها.

لبدء هذه التجربة، يتم حصاد الخلايا الملتصقة عند وصول درجة التلاقي إلى 90%. أولاً، يتم سحب وسط الزرع وشطف طبقة الخلايا مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك، يتم سحب PBS وإضافة مليليترين من محلول trypsin-EDTA بتركيز 0.05% باستخدام الماصة فوق الطبقة أحادية الخلايا.

ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة عند درجة حرارة 37 °C واتركه حتى تنفصل الخلايا. بعد ذلك، أخرج الطبق من الحاضنة وأوقف عملية التثبيت. أضف 2 mL من الوسط الغذائي الكامل.

استخدم ماصة سعة 5 mL لترشيح الخليط حتى تصبح الخلايا معلقة بالكامل. ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. أضف باستخدام الماصة 40 µL من محلول DNA بتركيز 10 mg/mL إلى معلق الخلايا، واتركه ليتأقلم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق بعد عملية التحضير.

قم برجّ معلق الخلايا سريعاً باستخدام جهاز vortex، ثم قم بالطرد المركزي عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. بمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، اسحب السائل العلوي (supernatant) وتخلص منه، ثم أعد تعليق الراسب في 1 mL من الوسط الكامل لغسله. كرر عملية الطرد المركزي وأعد تعليق الراسب في 1 mL من الوسط الكامل.

بعد ذلك، قم بإجراء عد للخلايا باستخدام عداد خلايا آلي أو مقياس دم (hemo cytometer). قم بتعديل معلق الخلايا باستخدام الوسط الغذائي للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2.5 × 10⁶ خلية/ملل. ثم انتقل إلى مرحلة تكوين القطرات المعلقة.

قم بتحضير غرفة ترطيب عن طريق إزالة الغطاء من طبق زراعة أنسجة سعة 60 مليمتر، ثم سحب خمسة milliliters من PBS ونقلها إلى قاع الطبق. اقلب غطاء الطبق وقم بتنقيط ما يصل إلى 2010 microliter من معلق الخلايا على الجانب السفلي من الغطاء. تأكد من وضع القطرات بمسافات كافية بحيث لا تتلامس.

أعد الغطاء الذي يحتوي على المزارع القطيرية برفق إلى قاعدة الطبق الذي يحتوي على PBS. ضع طبق المزرعة في حاضنة زراعة الأنسجة. اضبط درجة الحرارة عند 37 °C، ونسبة ثاني أكسيد الكربون عند 5%، والرطوبة عند 95%، واتركه في الحضانة طوال الليل.

راقب القطرات يومياً واستمر في الحضن حتى تتشكل إما صفائح خلوية أو تجمعات خلوية. وبمجرد تشكل الصفائح الخلوية أو التجمعات، انقلها إلى دوارق رج ذات قاع مستدير تحتوي على 3 mL من الوسط الغذائي الكامل. احضن الدوارق التي تحتوي على الصفائح الخلوية أو التجمعات في حمام مائي هزاز.

يتم الحفاظ على العينات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة تقريبًا حتى يمكن رؤية تكوّن الأجسام الستيرويدية تحت مجهر تشريحي. وبمجرد تشكّل الأجسام الستيرويدية، يمكن قياس تأثير التلاعبات التجريبية على تكوّن هذه الأجسام وفقًا للإجراء الموضح في البروتوكول المكتوب. كما يمكن الآن رؤية تداخل الصبغات الفلورية التي تم إدراجها مسبقًا في الغشاء باستخدام المجهر الفلوري.

توضح صورة مجهر الحقل المضيء هذه تجمع خلايا MLL لسرطان البروستاتا لدى الجرذان بعد 18 ساعة من الحضن باستخدام طريقة القطرة المعلقة. تُظهر هذه الصورة تجمعاً ثانياً من خلايا MLL تشكل بعد 18 ساعة من الزرع باستخدام طريقة القطرة المعلقة. لقد تم زرع هذه الخلايا في وجود 25 micromolar من مثبط MEK وهو PD 9 8 0 5 9، مما أدى إلى تكوين تجمع خلوي أكثر تماسكاً بشكل ملحوظ.

يوضح الشكل هنا الفرق في حجم التجمعات بين مستنبتات قطرة MLL المعلقة المعالجة بمثبط MEK وتجمعات المجموعة الضابطة غير المعالجة. تمثل النجمة فرقاً ذا دلالة إحصائية حيث أن P أقل من 0.0001. وبناءً على اختبار T للطلاب بين التجمعات غير المعالجة وتلك المعالجة بمثبط MEK، يتضح أن المعالجة بمثبط MEK تؤدي إلى تكوين تجمعات أصغر حجماً وأكثر تماسكاً بشكل ملحوظ.

تم التقاط هذه الصورة باستخدام مجهر ستيريو Nikon Smz 800، وهي توضح جسماً كروياً تشكل عن طريق تحضين خلايا كبد جنين الدجاج في مستنبت القطرة المعلقة لمدة 18 ساعة، ثم في حمام مائي هزاز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تُظهر صورة المجهر البؤري هذه سلوك الفرز الذي يحدث عندما يتم استزراع مجموعات خلوية معينة معاً باستخدام طريقة القطرة المعلقة؛ وقبل البدء في مستنبت القطرة المعلقة، تم صبغ خلايا كبد جنين الدجاج بصبغة pkh two لغشاء الخلايا.

صُبغت خلايا القلب بـ PKH 26. ثم خُلطت معلقات الخلايا ووُضعت في قطرات معلقة. أُجريت المزرعة لمدة 18 ساعة، تلتها فترة حضانة لمدة 48 ساعة في حمام مائي هزاز عند درجة حرارة 37 degrees Celsius.

يمكن ملاحظة المقطع البصري أن خلايا القلب الملونة باللون الأصفر محاطة بخلايا الكبد. تظهر هنا باللون الأزرق الزائف استنساخان من خلايا L المعدلة وراثياً والتي تعبر عن NCA على أسطحها. وبنسبة 2.4 إلى واحد، تم صبغها بصبغات الغشاء الفلورية PKH 2 و PK KH 26 المخلوطة بنسب متساوية، وزُرعت كقطرات معلقة كما سبق.

في هذا المثال، تظهر الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية من الـ cadian باللون الأخضر الاصطناعي، وهي محاطة بالخلايا التي تعبر عن مستويات منخفضة من الـ en cadian والملونة باللون الأحمر الاصطناعي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في 30 دقيقة أو أقل إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.