بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تثبيط تعبير الجين المستهدف في خلايا DCS عن طريق ترانسفكشن siRNA. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال برمجة جهاز AM Maxin Nucleo effector. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في خلط خلايا DCS مع siRNA معاً، ثم نقل محلول الخلايا الناتج باستخدام الماصة إلى وحدات Nucleo QVE.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في وضع الطبق في صينية مكوك amaxa لبدء عملية عفن الخلايا (transfection). والخطوة النهائية من الإجراء هي إصابة الخلايا بالفيروس لتنشيط استجابة الإنترفيرون. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تثبيط الجينات من خلال تقنية quantitative R-T-P-C-R ولطخة ويسترن (Western blotting).

تُعد هذه التقنية قيمة لتوصيف مسارات التأشير في الخلايا التغصنية، وقد تساهم في تطوير العلاجات المناعية القائمة على الخلايا التغصنية. لبرمجة عامل النواة الخاص بمكوك Maxon ذي الـ 96 بئراً لعملية عفن الخلايا التغصنية، افتح ملف معاملات جديداً. حدد عدد الآبار التي ستستخدمها لعملية العفن القياسية عن طريق سحب المؤشر فوق مخطط الصفيحة ذات الـ 96 بئراً.

استخدم ثلاثة آبار على الأقل للتجميع لكل عينة تجريبية. الآن، أدخل رمز البرنامج في الجزء الأول باختيار F، و F، وفي الجزء الثاني، اختر 1 68 من القوائم المنسدلة. ثم من مربع المحلول، اختر monocyte human، وبعد ذلك من خيار التحكم اختر standard، ثم انقر فوق apply.

لتضمين ضابط عدم ترانسفكشن (no transfection control)، يلزم اختيار آبار إضافية من المخطط. ثم من خيار الضوابط (control option)، اختر ضابط عدم البرمجة (no program control) وانقر على تطبيق (apply) مرة أخرى. بعد خلط محلول النوكليوفيكشن (nucleofection solution)، اتركه ليدفأ حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

ضع عدد وحدات nucleo vete المطلوبة في طبق nucleo VETE بالاتجاه الصحيح كما هو موضح هنا، وذلك بإدخال الوحدة الأولى في الأنبوبين الأول والثاني، ثم تكرار ذلك لجميع الأنابيب التالية. انقل كمية كافية من DCS من قارورة زراعة الخلايا إلى أنبوب سعة 50 milliliter للحصول على 500,000 خلية لكل بئر لعملية transfection؛ قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة 10 minutes عند 400 G في درجة حرارة أربع degrees Celsius، ثم أزل الطافي بعناية. بعد ذلك، أضف محلول nuclear affection إلى الأنبوب، ثم أعد تعليق DCS عن طريق السحب والطرد اللطيف باستخدام الماصة لعدة مرات.

الآن، قم بتسمية أنابيب DPH وفقاً للمعالجة المحددة التي سيتم إجراؤها، ثم وزع الخلايا المعاد تعليقها على الأنابيب المسمىّة. أضف SI RNA بتركيز نهائي قدره 0.25 micrograms لكل 500, 000 خلية إلى أنابيب epi endorf المناسبة، ثم اخلط معلقات الخلايا باستخدام الماصة. استخدم non-target SI RNA لعينة الضبط بدون ترانسفكشن (no transfection control).

بعد ذلك، يتم سحب 20 µL من معلق خلايا SI RA DC ونقلها إلى وحدات nucleo vete وفقاً للمخطط التجريبي المبرمج مسبقاً، مع التأكد من وصول السائل إلى قاع البئر. يتم تغطية لوحة nucleo vete بالغطاء والنقر على اللوحة فوق سطح صلب بضع مرات لتسهيل إزالة الفقاعات الهوائية من أجل ترانسفكشن خلايا dcs. يتم إدخال لوحة nucleo Yvette المجهزة في صينية النقل الخاصة بـ nucleo effector 96 well. ثم يتم النقر على زر الرفع والبدء (upload and start).

تابع تقدم عملية عفن الخلايا (transfection) على الشاشة. يشير الصليب الأسود على خلفية خضراء إلى نجاح عملية عفن الخلايا في تلك البئر، بينما يشير الشريط الأسود على خلفية حمراء إلى فشلها أثناء عملية عفن الخلايا. قم بتدفئة وسط نمو DC مسبقاً عند اكتمال عملية عفن الخلايا، ثم أخرج الطبق وأضف 80 µL من وسط نمو DC المُدفأ مسبقاً إلى كل بئر.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم الآن بحضانة اللوحة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و5%CO2. خلال فترة الحضانة، أضف 100 µL من وسط نمو DC المسخن مسبقاً إلى أنابيب المصفوفة بنفس ترتيب إعداد لوحة nucleo cuvette. بعد انتهاء فترة الحضانة، انقل جميع الـ 100 µL من المعلقات الخلوية من nucleo CVEs إلى أنابيب المصفوفة المجهزة مسبقاً.

بعد ذلك، قم بإزالة والتخلص من الأنابيب التي لم تحدث فيها عملية transfection. وأخيراً، قم بتحضين أنابيب المصفوفة لمدة 24 ساعة أو أي فاصل زمني آخر مطلوب. ضع ملصقات على أنابيب einor لكل من أنابيب المصفوفة التي يتم تحضينها.

ثم انقل أنابيب المصفوفة من الحاضنة إلى غطاء ميكروبي لزراعة الخلايا، واجمع أنابيب المصفوفة الخاصة بكل عينة تجريبية في أنابيب eend dfs المصنفة مسبقاً. بعد ذلك، قم بترسيب الخلايا برفق عن طريق تدوير أنابيب eend DPH في جهاز طرد مركزي مكتبي لمدة 10 دقائق عند 400 G، ثم أزل السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في وسط نمو خالٍ من المصل يحتوي على فيروس مرض نيوكاسل أو NDV بمعدل عدوى (MOI) مقداره واحد بشكل غير متماسك.

قم بتغطية الـ epi endorphins بطريقة معقمة، ثم حضن الأنابيب لمدة 45 دقيقة. بعد فترة التحضين هذه، أضف 900 µL من وسط نمو DC وأعد تحضين الأنابيب لمدة تتراوح بين ثماني إلى 10 ساعات أخرى، وذلك لحصاد خلايا الـ dcs التي تم نقل الجينات إليها وإصابتها.

يتم تجميع الخلايا في شكل كريات عن طريق تدوير أنابيب einor في جهاز طرد مركزي مكتبي كما سبق، وإزالة snat. تم نقل dcs أحادية الخلايا إما باستخدام iRNA يستهدف RIG I أو glow irna غير متخصص، ثم أُصيبت بفيروس NDV كما تشير علامة الجمع (+)، أو ظلت غير مصابة كما تشير علامة الطرح (-)، وذلك كما تم الكشف عنه بواسطة quantitative R-T-P-C-R-A. لوحظ انخفاض في مستويات R RGA بنسبة 75% على مستوى النسخ، كما لوحظ انخفاض مماثل في تعبير interferon beta. كما لوحظ أيضاً تأثير على أحد العناصر الفعالة المصبة لـ RGA في شلال إشارات الإنترفيرون. علاوة على ذلك، لم يكن تعبير interferon beta قابلاً للكشف في الخلايا الضابطة المنقولة وغير المصابة.

بينما كان استجابة جين MXA والجينات التابعة للإنترفيرون بيتا ضئيلة. هنا، تُعرض بيانات عملية ترانسفكشن ثانية لخلايا DCS باستخدام irna الذي يستهدف rigi، والتي أُجريت كما في الشكل السابق. ومع ذلك، تم إصابة جميع الخلايا بفيروس NDV، كما أُضيف تحكم إضافي باستخدام خلايا Monocyte DCS غير المستأصلة.

كانت نتائج إسكات الجين مشابهة لتلك التي لوحظت في الشكل السابق. وقد كشف تحليل لطخة ويسترن (western blot) للكشف عن RGA أن التعبير البروتيني لهذا الجين قد تم تثبيطه بالكامل. وتظهر الحارتان الأولى والثانية بيانات المستخلصات من خلايا غير مستأصلة.

تظهر الحارتان الثالثة والرابعة نواتج تحلل الخلايا التي تم نقل glow irna إليها، وتظهر الحارتان الخامسة والسادسة نواتج تحلل الخلايا التي تم نقل S Irna المستهدف لـ RIG I إليها. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة واحدة، بما في ذلك تثبيط العديد من الجينات في وقت واحد.