قياس التردد من ورم الخلايا باستخدام الحد من نشر زرع الخلايا في التخفيف اسماك الزرد مسانج

يُعد اختبار زرع الخلايا بالتخفيف المحدود هو المعيار الذهبي لتقييم إمكانية التجديد الذاتي في النماذج الحيوانية التجريبية. في هذا العرض التوضيحي، يتم حقن أجنة أسماك الزيبرا المتماثلة جينياً في مرحلة خلية واحدة بـ rag two MIC و RAG two GFP لإنشاء أسماك زيبرا معدلة وراثياً ستطور سرطان الدم اللمفاوي الحاد للخلايا التائية الموسومة فلوريسنتياً. وبحلول اليوم 60 من العمر، يتم عزل خلايا سرطان الدم الأولية من أسماك الزيبرا ثم تنقيتها باستخدام فرز الخلايا المنشط فلوريسنتياً.

بعد ذلك، تُزرع الخلايا بتخفيف محدد في التجويف البريتوني لأسماك zebrafish البالغة، وتتم مراقبة الأسماك لرصد نمو الورم لمدة تصل إلى 90 يوماً. وأخيراً، يُستخدم برنامج التحليل الإحصائي الخاص بتحليل التخفيف المحدد للغاية لتقدير وتحديد تكرار الخلايا المسببة لانتشار اللوكيميا داخل الورم الأصلي. يتيح تحليل زرع الخلايا بالتخفيف المحدد للباحثين تقييم عدد الخلايا ذاتية التجدد الموجودة ضمن الكتلة الورمية الإجمالية بدقة.

تعد هذه الخلايا ذاتية التجدد هي المحرك لتشكل السرطان والمسؤولة في نهاية المطاف عن الانتكاسة. وتكمن الميزة الرئيسية لإجراء مقايسات الزرع بالتخفيف المحدود في نموذج سمك الزيبرا في إمكانية زرع العديد من الأسماك في كل تجربة، مما يؤدي إلى دقة أفضل عند تحديد تردد الخلايا الورمية المسببة للانتشار ذاتية التجدد. وتوفر هذه الطريقة رؤية متعمقة حول الخلايا الورمية المسببة للانتشار في سرطان اللوكيميا اللمفاوية الحادة من نوع T-cell.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضًا لفهم نماذج أخرى من السرطان في سمك الزيبرا. ستقوم جيسيكا بلاكبرن، زميلة في المختبر، وسالي ليو، فنية موهوبة، بشرح الإجراء لكم اليوم. لخطتة (linearize) بنيات Rag two CM و RAG two G-F-P-D-N-A، يتم هضم 10 micrograms من كل بلازميد باستخدام إنزيم القطع not one عند 37 degrees Celsius طوال الليل. وبعد عملية الاستخلاص بالفينول والكلوروفورم والترسيب بالإيثانول، نقوم بتعليق كل بلازميد في 20 microliters من الماء.

حدد تركيزات DNA على هلام أغاروز بتركيز 1% عن طريق إجراء تخفيفات بنسبة واحد إلى واحد، وواحد إلى خمسة، وواحد إلى 10 لكل بلازميد مهضوم، مع استخدام 20 µL و 10 µL و 5 µL من سلم DNA واسع المدى. الآن قم بتخفيف DNA إلى تركيز نهائي قدره 60 ng/µL للحقن في سلالة CG1 syngen. في أجنة سمك الزيبرا، احقن 250 nL من rag2 CM بتركيز 30 ng/µL و 30 ng/µL.

قم بحقن اثنين من GFP في أجنة سمك الزيبرفيش في مرحلة الخلية الواحدة، مع استهداف الحمض النووي (DNA) مباشرة داخل الخلية وليس في المح желك. تُحفظ الأجنة المحقونة عند درجة حرارة 28.5 °C، وتُزال الأجنة الميتة بعد 24 ساعة. عند بلوغ خمسة أيام من العمر، تُنقل الحيوانات إلى أحواض كبيرة بعد حوالي 28 يومًا من الحقن. يتم تخدير يرقات سمك الزيبرفيش بإضافة 200 µL من tricaine بتركيز 4 ng/mL إلى 25 mL من مياه نظام الأسماك في طبق بتري.

افحص اليرقات للتأكد من تطور TALL المسمى بفلورية باستخدام مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescence microscope) للكشف عن فلورية GFP. افصل اليرقات الإيجابية للأورام عن اليرقات السلبية لضمان عدم إغفال أي أسماك مصابة باللوكيميا في التحليل. يمكن فحص اليرقات السلبية في نقطة زمنية لاحقة بمجرد احتمال نمو الأورام بشكل أكبر. راقب الأسماك المصابة باللوكيميا والمسمى بفلورية مرة واحدة على الأقل أسبوعياً باستخدام المجهر الفلوري الانعكاسي لتتبع نمو الورم.

عندما تستحوذ خلايا اللوكيميا الموجبة لـ GFP على أكثر من 50% من جسم الحيوان، أضف واحد ملليلتر من Trica S بتركيز أربعة نانوغرام لكل ملليلتر في طبق بتري يحتوي على تسعة ملليلتر من مياه نظام الأسماك للتضحية بالسمكة، ثم ضع السمكة في طبق بتري جديد يحتوي على واحد ملليلتر من مصل جنين البقر بتركيز 5% في 0.9 XPBS. قم بهرس السمكة باستخدام شفرة حلاقة، ثم استخدم الماصة لخلط المزيج من أجل تفكيك تجمعات الخلايا الكبيرة. بعد ذلك، مرر الخلايا عبر مصفاة شبكية بقطر 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 ملليلتر.

انقل 500 µL من الخلايا باستخدام الماصة إلى أنبوب بوليسترين سعة 4 mL. أضف 1 µL من يوديد البريديوم بتركيز 1 mg/mL لوسم الخلايا الميتة، ثم قم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس، وبعد ذلك احتفظ بالخلايا على الثلج. قم أيضاً بتجهيز سمكة من النوع البري CG1 لجمع خلايا دم طبيعية، والتي ستعمل كحامل للخلايا الورمية أثناء عملية الزرع، وذلك بإضافة 4 mL من 5% FPS في 0.9 X PBS إلى أنبوب سعة 50 mL ليصبح الحجم الإجمالي 5 mL.

قم بعدّ خلايا الدم الطبيعية وتخفيفها لتصل إلى 3 × 10⁵ خلية لكل ملليلتر في 5% FBS في 0.9 x pbs، ثم اسحب باستخدام الماصة 100 µL لكل بئر من طبق يحتوي على 96 بئراً. باستخدام جهاز فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)، قم بفرز الخلايا الورمية الموجبة لـ GFP والسالبة لـ PI في طبق الـ 96 بئراً الذي يحتوي على خلايا الدم بالجرعات المحددة. بالإضافة إلى ذلك، قم بفرز 10,000 خلية في بئر لا يحتوي على خلايا دم طبيعية، وأعد تحليلها باستخدام جهاز FACS لتقييم نقية وحيوية الخلايا المفروزة. قم بطرد طبق الـ 96 بئراً مركزياً عند 2000 ×g لمدة 10 دقائق لترسيب الخلايا.

قم بإزالة 95 µL من الـ snat وأعد تعليق الخلايا في الخمسة µL المتبقية. احقن معلق الخلايا في التجويف البريتوني لأسماك الزيبرفيش (zebrafish) البالغة والمتماثلة جينياً والتي يتجاوز عمرها 60 يوماً باستخدام محقنة دقيقة قياس 26.5 gauge. لا يشترط تخدير أسماك الزيبرفيش قبل عملية الزرع.

قم بنقل 10 خلايا لوكيميا إلى 45 سمكة، و100 خلية إلى 20 سمكة، و1000 خلية إلى سبع سمكات، و10,000 خلية TALL إلى خمس سمكات، وذلك بعد 28 يوماً تقريباً من عملية النقل. افحص أسماك الزيبرا المستقبلة باستخدام مجهر فلوري فوقي (epi fluorescence microscope) باستخدام طول موجي للإثارة 4 85 20 ومرشح انبعاث 5 30 25، وذلك للكشف عن فلورة GFP.

سجل عدد الأسماك الإيجابية بالنسبة للعدد الإجمالي للأسماك المحقونة. أعد فحص الأسماك كل 14 يوماً لمدة تصل إلى 90 يوماً، وسجل عدد الأسماك الإيجابية. وذلك عندما تصبح الأسماك الإيجابية للأورام أكثر وفرة.

يتم التضحية بالحيوان عن طريق جرعة زائدة من trica US، ثم تُدخل النتائج في جدول ويُرفع البيانات إلى برنامج تحليل التخفيف المحدود للغاية القائم على الويب لتحديد تردد خلايا لوكيميا ذات التجدد الذاتي ضمن سلالة TALL CG one الأولية؛ حيث حُقنت الأجنة بـ RAG two cmic وفُحصت يرقات RAG two GFP للكشف عن TALL الأولية. بعد 28 يوماً، وتماشياً مع الأعمال السابقة، فإن حوالي 5% من الأسماك المحقونة تمتلك خلايا T موجبة لـ GFP داخل الغدة الزعترية، و100% من هذه الأسماك ستصاب باللوكيميا. هنا، تم فرز خلايا TALL الموصومة فلورياً من حيوانات مريضة تبلغ من العمر 65 يوماً واستخدامها في مقايسة زرع الخلايا بالتخفيف المحدود. أولاً، تم رسم بوابة (gate) لاختيار الخلايا المفردة.

بعد ذلك، تم اختيار الخلايا السلبية لصبغة propidium iodide. وفي النهاية، تم رسم بوابة (gate) لاختيار خلايا اللوكيميا الموجبة لـ GFP فقط من أجل الفرز. وفي هذا المثال للأسماك التي زُرعت فيها خلايا TALL في اليوم 28، ظهرت الأورام في مراحلها المبكرة كمنطقة من الخلايا الموجبة لـ GFP بالقرب من موقع الحقن.

بينما كانت بعض سلالات TLS أكثر تقدماً، حيث تمددت لتملأ التجويف البريتوني في هذه التجارب، تم إجراء الزرع لأكثر من 220 حيواناً، وهو أمر يمكن لشخص واحد إنجازه بسهولة خلال عدة ساعات. وأظهر تحليل البيانات باستخدام برنامج elda أن متوسط خلية واحدة من بين كل 135 من خلايا T all كانت خلايا مسببة لانتشار اللوكيميا وقادرة على التجدد الذاتي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية زرع الخلايا الورمية بتخفيف محدود في التجويف البريتوني لأسماك الزيبرا المتماثلة جينياً، وكيفية استخدام البيانات الناتجة لتحديد تردد الخلايا المسببة لانتشار الورم داخل ورم معين.

قد تساعد الدراسات الإضافية التي تستخدم حيوانات معدلة وراثياً في تحديد الآليات التي تتحكم في التجدد الذاتي لهذه الخلايا المسببة للأورام.