تحديد وتحليل الأسلاف محمر ماوس باستخدام CD71/TER119 التدفق cytometric الفحص

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد سلائف خلايا الدم الحمراء مباشرة في الأنسجة المأخوذة حديثاً من الفئران. يتيح لنا ذلك دراسة خصائصها الجزيئية خلال الفترات التي يشهد فيها الجهاز المكون للكريات الحمراء في هذه الفئران تغيرات. على سبيل المثال، خلال التطور الجنيني أو أثناء الاستجابة للإجهاد الناجم عن نقص الأكسجين، يتم أولاً عزل النسيج المكون للدم من كبد الفأر الجنيني أو الطحال أو نخاع العظم لدى البالغين، ثم يتم تفكيكه إلى معلق من الخلايا المفردة.

بعد ذلك، يتم وسم الخلايا باستخدام أجسام مضادة ضد علامات سطح الخلية CD 71 و TER one 19، وأي علامات أخرى ذات أهمية، على سبيل المثال، لقياس بقاء الخلايا أو حالة الدورة الخلوية، ثم يتم تحليل معلق الخلايا الموُسم باستخدام محلل قياس التدفق الخلوي وتحديد مجموعات فرعية معينة من أرومات الكريات الحمراء في مراحل نضج متميزة. ويمكن تنقية هذه المجموعات الفرعية المحددة عن طريق فرز الخلايا. لاحقاً، يمكن إجراء تحليل خلوي وجزيئي لكل مجموعة فرعية من مراحل نضج أرومات الكريات الحمراء.

تتيح لنا القدرة على تحديد الخلايا الحمراء الأولية (erythroblasts) في مراحل نضج محددة مباشرةً في الأنسجة المكونة للدم المعزولة حديثاً فرصة دراسة هذه الخلايا في القشرة الفسيولوجية. وبناءً على ذلك، تسمح لنا هذه الطريقة بدراسة استجابة الخلايا الحمراء الأولية في مراحل نضج مختلفة داخل الجسم الحي (in vivo)، حيث تسرع الفئران من معدل تكوين الكريات الحمراء عند تعرضها للمحفزات.

على سبيل المثال، الظروف التي تسبب نقص الأكسجة والتي تحاكي الارتفاعات العالية، أو حقن هرمون الإريثروبويتين. نحن نستخدم قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات لتحديد الخلايا أرومة الحمراء (erythroblasts) ضمن بيئة نسيجية معقدة، ودراسة إشارات البقاء وحالة الدورة الخلوية فيها في آن واحد. كما يمكننا فرز أرومة الحمراء في مراحل نضجها المحددة مباشرة من الأنسجة الطازجة واستكشاف مستويات التعبير الجيني، أو حالة الكروماتين، أو الوظائف الجزيئية الأخرى.

تحدث عملية تكوين الكريات الحمراء النهائية في الفأر داخل الطحال ونخاع العظام للفأر البالغ. وبناءً على ذلك، سيتم استئصال هذه الأنسجة من فأر تم القتل الرحيم له. وبعد القتل الرحيم للفأر، يتم سحب الدم عن طريق ثقب القلب في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على EDTA أو الهيبارين، حيث سيُستخدم هذا الدم لاحقاً لقياس حجم الخلايا المكدسة (hematocrit)، أو عد الخلايا الشبكية، أو إجراء تحليل صورة الدم الكاملة (CBC).

ضع الطحال وعظم الفخذ اللذين تم حصادهما في أنابيب منفصلة تحتوي على محلول صبغة مُبرّد (staining Buffer). حافظ على الأنسجة المحصودة على الثلج إذا لزم الأمر. قم بوزن الطحال.

من المرجح أن تُظهر الفئران التي تمر باستجابة إجهاد تكوين الكريات الحمراء زيادة ملحوظة في وزن الطحال. وبناءً على ذلك، يتم تحضير خلايا الطحال وخلايا نخاع العظم من الأنسجة المستخلصة وفقاً للإجراءات التي تم توضيحها سابقاً في جنين الفأر. ويحدث تكوين الكريات الحمراء النهائي في كبد الجنين بين اليومين الجنينيين 12.5 و 15.5.

يتم تحضير إناث الفئران الحوامل ذات الحمل المؤرخ للحصول على خلايا كبد جنينية في الأيام من 12.5 إلى 14.5 من الحمل. يتم القتل الرحيم لإناث الفئران الحوامل المؤرخة، ثم تُنقل القرون الرحمية إلى طبق بتري يحتوي على ثلج، وسط زراعة بارد أو محلول صبغة.

يلزم استخدام مجهر تشريحي لتشريح كبد الجنين من اليوم الجنيني 12.5 أو أصغر لإخراج الأجنة من الرحم. أولاً، افصل كل خرزة عن القرن. ثم استأصل جدار الرحم بلطف لتحرير الجنين الموجود داخل كيسه السلوي.

قشر الغشاء السلوي برفق. يكون كبد الجنين هو أكبر نسيج أحمر في البطن ويقع أسفل القلب الذي يكون أصغر حجماً بكثير. لتشريح كبد الجنين، استخدم الملقط لتثبيت الجنين من كلا جانبي الكبد، ثم ادفع الكبد برفق خارج تجويف البطن إلى الوسط.

انقل الكبد برفق إلى أنبوب يحتوي على محلول صبغ طازج. بعد تشريح جميع أكباد الأجنة ونقلها إلى أنبوب يحتوي على محلول صبغ طازج، قم بتفكيك الأكباد ميكانيكياً عن طريق السحب بالماصة، ثم قم بترشيح الخلايا المفككة عبر شاشة نايلون مسامية بحجم 40 ميكرون. اغسل الخلايا مرتين عن طريق الطرد المركزي، مع التخلص من الراشح وإعادة تعليق الخلايا في محلول الصبغ.

بعد الغسلة الثانية، صبغ الخلايا بصبغة tripan blue وعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). يحتوي الكبد الجنيني في المرحلة E 13.5 على حوالي 10⁷ خلية. أعد تعليق الخلايا بتركيز يتراوح من 1 إلى 2 × 10⁶ خلية لكل عينة بحجم 200 µL لإجراء تحليل التدفق الخلوي (flow cytometric analysis).

لأغراض هذا البروتوكول المرئي، سيتم عرض صباغة الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي على خلايا الكبد الجنينية فقط. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير مزيج مسبق للصباغة بالأجسام المضادة الأولية يحتوي على ما يلي: IgG أرنب منقى لحجب مستقبلات FC في خلايا الفئران، وCD 71 FETR one 19 PE، وجسم مضاد موجه ضد بروتين سطح الخلية fast. اخلط محلول الأجسام المضادة بلطف عن طريق قلب الأنبوب من مرتين إلى ثلاث مرات، ثم أضف 200 µL من المزيج المسبق للصباغة بالأجسام المضادة الأولية إلى عينة خلايا الكبد الجنينية التي تم تحضيرها مسبقاً، وقم بسحب السائل ودفعه بالماصة بلطف لإعادة تعليق الخلايا.

بعد ذلك، قم بتحضير عينات الخلايا الست الضابطة هذه. عينة غير مصبوغة تُترك فيها الخلايا في محلول صبغ لتحديد التألق الذاتي الخلفي للخلايا، ولون واحد لكل جسم مضاد أو لون مستخدم في البروتوكول لتصحيح التداخل الطيفي بين القنوات، وهي في هذه التجربة TUR one 19 PE CD 71 fz fast، وbiotin وstreptavidin A PC، وضابط fluorescence minus one لـ fast biotin، والذي يحدد الخلفية الحقيقية لتلك القناة حيث يتم صبغ الخلايا بجميع الألوان أو الأجسام المضادة الموجودة في البروتوكول باستثناء fast biotin. قم بحضن العينة والضوابط ذات الصلة في صبغة الجسم المضاد الأولي على الثلج لمدة تتراوح من 45 دقيقة إلى ساعة واحدة في الظلام.

في نهاية فترة الحضن، اغسل الخلايا بإضافة 3 mL من محلول صبغ إلى كل أنبوب عينة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة تتراوح من 3 إلى 5 دقائق عند 400 ×g تقريبًا في درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، أضف strep avid في PC واحضن الأنابيب على الثلج لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة. عند اكتمال فترة الحضن، اغسل الخلايا كما تم في خطوة صبغ الجسم المضاد الأول.

أخيرًا، أعد تعليق الخلايا في محلول الصبغ الذي يحتوي على صبغة DNA غير النفوذة للخلايا seven a a d لاستبعاد الخلايا الميتة. العينات الآن جاهزة لتحليل قياس التدفق الخلوي. الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو تحليل تحديد البوابات (gating analysis) الصحيح لأحداث قياس التدفق الخلوي، مما يسمح بتحديد المجموعات الفرعية للأرومات الحمراء (erythroblast) بشكل موثوق.

يتطلب الأمر إعداداً دقيقاً للجهاز وكافة عينات الضبط الصحيحة، وتعويضاً دقيقاً للتداخل الطيفي، ومن ثم تحديد بوابات استبعاد (gating) الخلايا الميتة، والتكتلات، والأحداث صغيرة الحجم جداً. في بداية تحليل البيانات، تُستخدم العينة غير المصبوغة وعينات الضبط أحادية اللون لضبط تعويض التداخل الطيفي لكل تركيبة لونية.

في هذا المثال، سنوضح كيف يتسرب فلورسنت fit E إلى قناة PE وكيف يتم تصحيح هذا التداخل الطيفي بعد عملية التعويض. أولاً، باستخدام ضابط غير مصبوغ، نحدد منطقة موجبة لـ fit E وسالبة لـ PE. بعد ذلك، وباستخدام ضابط اللون الواحد لـ fit E، يمكننا تصور التسرب الطيفي في قناة PE.

بعد إجراء التعويض الرقمي باستخدام برنامج FlowJo، يتم تقليل إشارة تداخل spillover fit E في قناة PE. وبمجرد إتمام التعويض، يمكن إزالة الخلايا الميتة والتجمعات والأحداث الصغيرة. يتم التخلص من التجمعات والمزدوجات الخلوية عن طريق رسم ارتفاع التشتت الأمامي مقابل مساحة التشتت الأمامي واختيار الأحداث الواقعة ضمن بوابة قطرية ضيقة.

يتم استبعاد الخلايا الميتة عن طريق اختيار الخلايا التي تعطي نتيجة سلبية لصبغة dapi، وهي صبغة DNA غير نفاذة للخلايا. كما تقوم بوابة الخلايا الحية السلبية لصبغة DAPI باستبعاد الأحداث الصغيرة جداً مثل النوى أو الحطام الخلوي، والتي تتميز بتشتت أمامي منخفض جداً. بعد ذلك، سنعرض استراتيجية تحديد البوابات لخلايا الكبد الجنيني.

تم وسم الخلايا المجمعة حديثاً بـ CD 71 TUR one 19، ومزيج من الأجسام المضادة الموجهة ضد واسمات السلالة غير الحمراء والموسومة بـ ZI. في هذا المثال، تم تعويض العينات بالفعل عن التداخل الطيفي، ثم تم تحديد بوابات لاستبعاد التجمعات والخلايا الميتة والأحداث الصغيرة جداً. نستخدم عينة FMO التي تحتوي على جميع الألوان باستثناء صبغة fitzy الإيجابية للسلالة لرسم مدرج تكراري لـ fitzy وتحديد بوابة الخلايا السلبية للسلالة، ثم نطبق هذه البوابة على عينة خلايا الكبد الجنيني التي صُبغت بواسمات السلالة المقترنة بـ ZI.

يتم اختيار الخلايا سالبة السلالة (Lineage negative) وتمثيلها بيانياً باستخدام CD 71 على المحور الصادي (Y axis) و TER one 19. وعلى المحور السيني (A axis)، أصبحت الخلايا الآن جاهزة للتقسيم إلى مجموعات فرعية من S zero إلى S five. وتحتوي المجموعة الفرعية S zero الناضبة من السلالة (Lin depleted) بشكل كبير على خلايا ذات إمكانات CFUE قبل بدء الاعتماد على EPO.

تحتوي المجموعة الفرعية S1 على خلايا CFUE المعتمدة على EPO والتي تكون في الغالب في طور S من دورة الخلية. أما خلايا المجموعة الفرعية S2 فقد فقدت القدرة على تكوين المستعمرات وبدأت في التعبير عن الهيموجلوبين. بينما تتكون خلايا المجموعة الفرعية S3 بشكل كبير من أرومات حمراء قاعدية (basophilic Erythroblasts)، وتحتوي المجموعات الفرعية S4 وS5 على أرومات حمراء متأخرة. يوضح الشكل هنا استراتيجية التحليل عقب عملية استحصال البيانات من خلايا الطحال التي تمت معالجتها ووسمها بأجسام مضادة موجهة نحو CD 71 و TER one 19، بالإضافة إلى المدرج التكراري لمستقبل الموت fast.

يُظهر المخطط الأول جميع الأحداث المكتسبة، حيث تمثل البوابة القطرية الأحداث التي يُرجح أنها خلايا مفردة، مع استبعاد الثنائيات أو التجمعات الأكبر. يتم تحليل الخلايا الموجودة في هذه البوابة بشكل أكبر في المدرج التكراري الثاني هنا. كما يتم استبعاد الأحداث الصغيرة جداً والتي يُرجح أنها نوى أو حطام خلوي.

تظهر الخلايا المختارة في المدرج التكراري الثالث، حيث تم استبعاد الخلايا الموجبة لـ DAPI، والتي يُرجح أنها خلايا موت مبرمج نفاذة الغشاء، من التحليل اللاحق. ويوضح المدرج التكراري الرابع الجمهرة الناتجة من خلايا الطحال الحيوية. تحتوي بوابة pro eGate على خلايا CD 71 high و TER one 19 Intermediate، بينما يتم تحليل خلايا tur R one 19 high بشكل أكبر في المدرج التكراري الخامس.

هنا، يتم تقسيم الخلايا ذات التعبير العالي عن CD 71 إلى خلايا أقل نضجاً ذات مساحة كبيرة، وهي erythroblasts A، وخلايا أصغر وأكثر نضجاً، وهي erythroblasts B. وتعتبر المجموعة ARI C هي الأكثر نضجاً من erythroblasts. يمكن قياس تعبير بروتينات سطح الخلية في وقت واحد لكل من هذه المجموعات عن طريق إضافة الأجسام المضادة ذات الصلة في نفس وقت إضافة TER R 19 و CD 71. يوضح مخطط التلوين six تعبير مستقبل الموت fast على سطح الخلية، تحديداً في المجموعة A لدى الفئران في الحالة الأساسية والفئران التي حُقنت بجرعة واحدة من E ppo.

تشير النتائج إلى أن EPO يثبط التعبير السريع في هذه المنطقة. كما يمكن قياس التعبير البروتيني داخل الخلايا أو حالة الدورة الخلوية لمجموعة من الخلايا في الجسم الحي (in vivo) لكل مجموعة فرعية. في هذا التحليل التمثيلي للدورة الخلوية، تم حقن الفئران بـ BRDU عن طريق الحقن داخل الصفاق، ثم تم حصاد نخاع العظم بعد 30 إلى 60 دقيقة.

بالإضافة إلى صبغ الخلايا لـ CD 71 وTER one 19، تم صبغها للكشف عن دمج BRDU في حمض D-N-A الخاص بها؛ حيث تكون الخلايا الموجبة ل-B-R-D-U في طور S من الدورة الخلوية. أما خلايا الطور البيني فتكون سالبة لـ BRDU ويمكن تقسيمها إلى طور G one أو طور G two M. وباستخدام DNAD seven A A D، يمكن فرز الخلايا من كل من المجموعات الفرعية PRO E area A A B و A EC.

تظهر الخلايا هنا في تحضيرات خلوية تبين النضج المتسلسل مع تناقص حجم الخلية وتكثف النواة وزيادة التلون البني الذي يعكس تعبير الهيموغلوبين. وأخيراً، يظهر هنا تحليل ممثل لدورة الخلية للمجموعة الفرعية S3 في كبد جنيني في اليوم 13.5. تم حقن الفئران الحوامل بـ BRDU.

تم استئصال أكباد الأجنة ثم تثبيتها ونفاذها وصبغها بالأجسام المضادة لـ CD 71 و TER one 19 و BRDU بعد مرور 30 إلى 60 دقيقة. تم تحليل حالة الدورة الخلوية لخلايا S3 حيث تكون خلايا مرحلة S موجبة لـ BRDU، وتم قياس محتوى DNA عن طريق الصبغ بصبغة DNA seven A a d.

يتيح النهج السيتومتري الذي نصفه الاستقصاء المتزامن للوظائف الخلوية مثل تعبير علامات سطح الخلية والبروتينات الأخرى، وبقاء الخلية، وتأشير الخلية باستخدام أجسام مضادة متخصصة، وحالة الدورة الخلوية. وبذلك، يتيح لنا هذا النهج دراسة الاستجابات الجزيئية لطلائع الكريات الحمراء، وهي مرحلة نضج مختلفة، تجاه مجموعة واسعة من المحفزات أو تأثير الطفرات الجينية. وتجدر الإشارة إلى أن مجموعات النضج في السيتومتري التدفقي يتم تعريفها بناءً على تعبير علامات سطح الخلية والتشتت الأمامي.

وجدنا أن الخلايا في كل مجموعة فرعية تتوافق بشكل عام مع مرحلة شكلية مماثلة من أرومات الكريات الحمراء في مجموعة واسعة من نماذج الفئران. ومع ذلك، نوصي بالتحقق من ذلك عند فحص نموذج فأر جديد. من خلال فرز الخلايا من كل مجموعة فرعية وفحص شكلها، يمكن أيضًا فرز الخلايا من كل مجموعة لإجراء تحليل RNA أو تحليل الترانسكريبتوم؛ لذا يجب أن تستخدم تجارب الفرز ضغوط فرز منخفضة وفوهات واسعة لتقليل إجهاد القص على الخلايا.

نوصي أيضاً بالتحقق من نقاء الخلايا وحيويتها بعد كل تجربة فرز. وأخيراً، عند اكتشاف تغيير في تكرار مجموعة فرعية معينة، من المهم تحديد ما إذا كان هذا ناتجاً عن تغيير حقيقي في عدد الخلايا في تلك المجموعة الفرعية أو ما إذا كان ناتجاً عن تغييرات في مجموعات فرعية أخرى. لذلك، وبالإضافة إلى قياس تكرارات المجموعات الفرعية، من الضروري دائماً قياس العدد المطلق للخلايا في كل مجموعة فرعية أيضاً.