الفلورسنت النانوية لقياس تركيز ايون في النظم البيولوجية

يتمثل الهدف العام من التجربة التالية في تصنيع مستشعرات نانوية للصوديوم لاستخدامها في تطبيقات في المختبر (in vitro) وفي الجسم الحي (in vivo). ويتحقق ذلك عن طريق تحضير خليط بصري (opto mixture) يحتوي على مكونات المستشعرات الخاصة بالمستشعرات النانوية. وكخطوة ثانية، يتم تعريض المادة الخافضة للتوتر السطحي للموجات فوق الصوتية في محلول مائي لضمان توزيعها بالتساوي، مما يسمح بتكوين المستشعرات النانوية عند إضافة الخليط البصري.

بعد ذلك، يُضاف الخليط الضوئي إلى خليط الماد المواد الخافضة للتوتر السطحي المائي تحت تأثير الموجات فوق الصوتية لتكوين المستشعرات النانوية في المحلول. يوضح هذا الفيديو أن استجابة المستشعر قابلة للضبط. كما يمكن حقن المستشعرات مجهرياً في الخلايا العضلية القلبية، كما يمكن حقنها تحت الجلد في الفئران.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل صبغات المؤشرات الفلورية، في إمكانية ضبط الحساسات لتناسب نطاقاً ديناميكياً يتوافق مع البيئة الفسيولوجية، وقياس نطاق أوسع من المواد التحليلية، وإجراء قياسات نسبية للتحليل الكمي. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات؛ لأنه بمجرد تصنيع الحساسات، قد يبدو إدخالها في بيئة بيولوجية أمراً شاقاً. يجب تحضير مخزونات من sodium ion four x dry sodium TFPB و chromo four three مسبقاً قبل تصنيع الـ opto وفقاً للبروتوكول المكتوب.

داخل خزانة استخلاص الغازات، اخلط جميع المواد في أنبوب زجاجي سعة 1.5 milliliter. باستخدام غطاء لولبي مطلي بالتفلون، قم برج الأنبوب برفق باستخدام جهاز Vortex حتى يذوب كل الـ PVC. يجب أن يظهر المحلول باللون الأحمر.

ابدأ في تحضير المستشعرات النانوية بإضافة 100 µL من Peg lipid بتركيز 10 mg/mL إلى قارورة زجاجية سعة 4 g. بعد ذلك، أضف 4 mL من المحلول المائي المطلوب، مثل 10 mM hippies.

قم بغمر رأس جهاز السونيكاشن بمقدار 7 mm داخل القنينة باستخدام رافعة مختبرية، وقم بتطبيق قدرة سونيكاشن منخفضة لمدة 30 ثانية. وفي أنبوب سعة 0.6 mL، اخلط 50 µL من المادة البصرية و 50 µL من ثنائي كلورو ميثان باستخدام الماصة لضمان الخلط المتجانس. بعد ذلك، ابدأ عملية السونيكاشن لمدة ثلاث دقائق.

مع بدء عملية السونيكاتة، أضف 100 µL من الخليط البصري عن طريق غمر طرف الماصة وتفريغ الحجم كاملاً في حقنة واحدة سريعة ومنتظمة. سيتغير لون المحلول إلى الأزرق إذا ارتفع الـ pH فوق سبعة، وفي حالة عدم وجود صوديوم لإزالة الـ THF المتبقي والـ di chloro methane من المحلول. حرّك رأس السونيكاتة إلى عمق 2 mm.

ومع مرور الدقائق الثلاث المتبقية، سيصبح المحلول عكراً. وبمجرد اكتمال عملية السونيكاتيون (Sonication)، اسحب محلول المستشعر النانوي (Nanosensor) باستخدام حقنة سعة 5 mL. ثم ثبّت مرشحاً وقم بتفريغ محلول المستشعر النانوي في قارورة زجاجية ذات غطاء لولبي.

ابدأ بتحضير 10 محاليل بتركيزات متزايدة تدريجياً من الصوديوم لقياس حساسية المستشعر النانوي مقابلها. اخلط محاليل الصوديوم القياسية بتركيز صفر مولار وواحد مولار في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter. الآن، في طبق 96 بئر ذي قاع بصري، أضف 100 microliters من كل تركيز من الصوديوم إلى ثلاث آبار في عمود واحد.

ثم أضف 100 µL من المستشعرات النانوية المحضرة حديثاً إلى كل بئر، وقم بتحميل الطبق في جهاز قياس الفلورية للأطباق الدقيقة (microplate fluorimeter)، وأدخل أطوال موجات الاستثارة والانبعاث والقطع المثالية للكروموفور المستخدم. يعتمد اختيار أطوال الموجات المقاسة على التطبيق؛ حيث تتيح هذه الأطوال الموجية إجراء قياسات الديناميكيات السريعة داخل الخلايا أو تقليل الضوضاء.

للحصول على قيم alpha، قم بقسمة نسبة الشدة عند 570 nanometers على الشدة عند 670 nanometers أو 680 nanometers. ثم ارسم قيم alpha مقابل لوغاريتم تركيز الصوديوم، مع تعيين لوغاريتم تركيز الصوديوم الصفر عند القيمة ناقص واحد.

قم الآن بمطابقة منحنى سيني (sigmoidal curve) مع الاستجابة، ومن خلال هذا المنحنى، احسب تركيز الصوديوم عند القيمة alpha التي تساوي 0.5. يمثل هذا تركيز الصوديوم الذي يستجيب عنده المستشعر بشكل أمثل. وبناءً على هذه المعلومات، اضبط نسبة sodium iono four x sodium TFPB و chromo iono four three في الـ opto لإنشاء مستشعرات نانوية ذات تركيز الصوديوم الأمثل.

على سبيل المثال، منحنيات استجابة البطل لخمس مجموعات مختلفة من المستشعرات النانوية التي تمثل تركيبات بصرية مختلفة، وتتفاوت فقط في كمية الصوديوم من أربعة 10. للتصوير داخل الخلايا، استبدل الوسط الخلوي بوسط شفاف مثل محلول Tyro وانقل الخلايا إلى غرفة التصوير. الآن، قم بملء ماصة زجاجية مسحوبة بمحلول المستشعر النانوي المُحضّر في 5 mg/mL من الجلوكوز في الماء.

بعد ذلك، قم بتثبيت الماصة على ميكرو-مناور (micro manipulator) وقم بتوصيلها بنظام حقن يتم التحكم فيه بالضغط. اخفض الماصة فوق الخلية ثم أدخلها في السيتوبلازم. قد يكون من الضروري أحياناً النقر على حامل المناور لاختراق الغشاء.

احقن بضع مئات من البيكولتر من محلول المستشعر النانوي واسحب الماصة بسرعة. قم بتخدير فأر عارٍ من نوع CD one باستخدام الإيزوفلورين عبر غرفة تخدير. وبمجرد تخدير الفأر، ضعه في غرفة تصوير معقمة.

بعد ذلك، املأ حقنة إنسولين معقمة بقياس 31 gauge بـ 10 µL من المستشعرات النانوية ذات قيمة KD المناسبة في 10 mM PBS. تأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء باستخدام الملاقط. أمسك طية صغيرة من الجلد على طول ظهر الفأر عند موقع الحقن المطلوب أثناء الإمساك بالجلد.

أدخل المحقنة في الجلد بحيث تكون فتحة الإبرة مائلة للأعلى وتكون الإبرة موازية لسطح الجلد. الآن، اسحب مكبس المحقنة للخلف للتأكد من أن الإبرة لم تخترق وعاءً دمويًا. ولتقليل الضغط العكسي، حرك الإبرة بلطف يمينًا ويسارًا لإنشاء جيب داخل الجلد.

ثم احقن المستشعرات وأخرج المحقنة برفق. اضغط بلطف على موقع الحقن وامسح أي محلول قد يكون قد تسرب منه. عادةً ما يتم إجراء ست حقنات موزعة بالتساوي على طول الظهر.

في حال إجراء العملية على فئران مختلفة، قم بتغيير الإبرة لتقليل احتمالية نقل المرض والتلوث الخلطي. بعد عمليات الحقن، قم بالتقاط صور بالمجال المضيء وصور فلورية باستخدام مجموعات مرشحات تتوافق بدقة مع طيف الإثارة والانبعاث الخاص بالمستشعرات النانوية؛ حيث يقلل ذلك أيضاً من الفلورة الذاتية للجلد.

تم استزراع هذه الخلايا العضلية القلبية حديثة الولادة على شريحة غطائية وحُقنت بمجسات نانوية للصوديوم. تَم التقاط هذه الصورة الفلورية عند طول موجي للإثارة يبلغ 639 نانومتر. وهذه صورة بالمجال المضيء للخلايا نفسها، وهذه صورة مدمجة للصورتين.

يحدث بعض التجمع للمجسات، ولكن تظهر الخلايا بمورفولوجيا طبيعية. انتشرت المجسات في جميع أنحاء السيتوبلازم ولا يوجد تحميل نووي. يوضح هذا التراكب بين صورة المجال المضيء والصورة الفلورية تسعة حقن مختلفة تحت الجلد لمجسات الصوديوم النانوية في الفراغ تحت الجلد لفأر عارٍ.

بمجرد تحضير مستشعرات نانوية من نوع Masten، يمكن إتمام عملية التصنيع في دقائق إذا تم تنفيذها بشكل صحيح وتطبيقها على أي بحث لقياس تدفق مادة تحليلية عكسية في الوقت الفعلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحميل المستشعرات النانوية في الحيز داخل الخلايا أو تحت الجلد لإجراء قياسات كمية في بيئة بيولوجية.