البوليمرات الذاكرة شكل خلية للثقافة أحدث

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة الخلايا في ركيزة ذات تضاريس تتغير بمرور الوقت. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال برمجة بوليمر ذاكرة الشكل في شكل دائم يمكن تذكره. ثم يتم برمجة بوليمر ذاكرة الشكل في شكل مؤقت يتم لاحقاً استزراع الخلايا عليه.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تحفيز بوليمر ذاكرة الشكل للعودة إلى شكله الدائم عن طريق زيادة درجة الحرارة، وفي النهاية يمكن الحصول على نتائج تظهر تغيراً في سلوك الخلايا من خلال المجهر الفلوري. مرحباً، اسمي بات ماذر، وأنا أستاذ في الهندسة الطبية الحيوية والكيميائية ومدير معهد سيراكيوز للمواد الحيوية هنا في جامعة سيراكيوز.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالأجهزة التجارية أو المخصصة لتمديد الخلايا في قدرتنا، من خلال نظام بوليمري واحد، على تطبيق مجموعة واسعة من الإجهادات المعقدة على الخلايا. اسمي جاي هندرسون، وأنا أستاذ مساعد في الهندسة الطبية الحيوية والكيميائية وعضو في معهد سيراكيوز للمواد الحيوية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الميكانيكا الحيوية (Mechanobiology)، مثل كيفية استجابة الخلايا للتغيرات الديناميكية في بيئتها الفيزيائية. اسمي كيفن ديفيس، وأنا طالب دكتوراه في جامعة سيراكيوز بقسم الهندسة الطبية الحيوية والهندسة الكيميائية. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الميكانيكا الحيوية ثنائية الأبعاد (2D)، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لأنظمة أخرى مثل السقالات ثلاثية الأبعاد (3D) متغيرة الشكل المستخدمة في هندسة الأنسجة.

قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتجهيز غرفة معالجة مخصصة باستخدام شريحة زجاجية، وفاصل من التفلون بسمك 1 mm، ولوح من الألومنيوم. قم بتثبيت الغرفة باستخدام مشابك مكتبية صغيرة، ثم ابدأ بحقن NOA 63 داخل الغرفة عبر فتحة في فاصل التفلون باستخدام إبرة مقاس 18 gauge. بعد ذلك، ضع الغرفة على لوح تسخين مضبوط عند درجة حرارة 125 °C.

اترك الغرفة لتسخن حتى تصل إلى درجة حرارة موحدة لمدة خمس دقائق بعد تسخين الغرفة. قم بمعالجة NOA 63 لمدة 20 دقيقة عن طريق وضع مصباح UV على مسافة 6.5 centimeters من سطح الزجاج. قم بإزالة NOA 63 من الغرفة بينما لا يزال دافئاً باستخدام شفرة حلاقة.

بعد ذلك، يتم إجراء المعالجة اللاحقة لبوليمر ذاكرة الشكل تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاث ساعات و40 دقيقة مباشرة على لوح تسخين عند درجة حرارة 125 °C. ولتوصيف ذاكرة الشكل لـ NOA 63، يتم تحضير عينة على شكل دمبل عن طريق الكبس الحراري للفيلم المعالج باستخدام خرامة مخصصة. وأخيراً، يتم تحميل العينة في محلل ميكانيكي ديناميكي مزود بملحق شد.

اضبط الجهاز على وضع التحكم في القوة وقم ببرمجة إجراء الاختبار كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق بهذا الفيديو. تكون نتيجة هذا الإجراء غشاءً من بوليمر ذاكرة الشكل (SMP) المعالج متساوي الحرارة؛ ضع غشاء CSMP على لوح ساخن واضبط درجة الحرارة لتكون أعلى من درجة حرارة الانتقال الزجاجي من أجل تقليل المعامل وتسهيل عملية القطع. لتحضير عينات فردية من غشاء s و p المعالج متساوي الحرارة.

قم بقص غشاء s و p باستخدام شفرة حلاقة للحصول على حجم العينة المطلوب. يمكن تثبيت الشكل المؤقت بعدة طرق مختلفة. هنا، يتم استخدام مكبس هيدروليكي مكتبي مزود بصفائح يمكن تسخينها وتبريدها لضغط تضاريس مؤقتة.

أولاً، اضبط درجة حرارة الـ PLAs عند درجة حرارة أعلى من tg. وفي هذا العرض التوضيحي، تم تصنيع أداة نقش عن طريق معالجة الإيبوكسي على أسطوانة فينيل لإنتاج شكل مؤقت من الأخاديد المتوازية. ويمكن تصنيع أداة النقش من مواد أخرى وبتضاريس مختلفة، ولكن يجب أن تكون أكثر صلابة من NOA 63.

عند درجة حرارة النقش، ضع عينات s و p ووجهها للأسفل على أداة النقش. بعد ذلك، ضع العينات وأداة النقش داخل المكبس. طبق حملاً مسبقاً قدره 100 kilo pascals تقريباً لتحقيق التلامس بين صفائح PLA الساخنة والعينات، واستمر في ذلك لمدة خمس دقائق تقريباً للسماح للعينات بالوصول إلى درجة حرارة موحدة.

بمجرد الوصول إلى درجة حرارة موحدة، يتم تسليط ضغط يتراوح من 1 إلى 6 megapascals على العينات لمدة دقيقة واحدة. سيحدث كسر في SMP. في حال تسليط إجهاد أكبر.

قم بتطبيق إجهادات أقل لإحداث تضاريس ذات سعات أصغر. بعد تطبيق الضغط، خفض درجة الحرارة إلى ما دون درجة الانتقال الزجاجي TG باستخدام خاصية التبريد المائي لصفائح المكبس. عندما تصبح درجة الحرارة أقل من tg، قم بإزالة القوة المطبقة قبل البدء في تجربة زراعة الخلايا النشطة.

يُستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV) في كابينة السلامة البيولوجية لتعقيم العينات. رتّب العينات بحيث يكون وجهها لأسفل في أطباق معقمة بدون أغطية، وقم بتشغيل ضوء UV لمدة ست ساعات. بعد ذلك، انقل العينات إلى أطباق معقمة جديدة بحيث يكون وجهها للأعلى.

قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة ست ساعات إضافية. يجب موازنة العينات للوصول إلى حالة مستقرة نسبياً قبل زراعتها بالخلايا. ضع العينات في طبق معايرة ذي 96 بئراً وأضف 150 µL من وسط النمو الكامل.

الوسط لكل بئر. ضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 30 degree Celsius مع 5%CO2 حتى الوصول إلى التعافي الجزئي المطلوب. في هذا العرض التوضيحي، يتم تحضين العينات لمدة 30 ساعة لإنتاج سعة كافية لمحاذاة الخلايا.

بمجرد تحقيق استعادة جزئية، يمكن زراعة الخلايا في العينات. ضع العينات في طبق 96 بئراً جديد. ثم أضف 150 µL من محلول الخلايا إلى كل عينة هنا، C3 H 10 t ونصف.

تُستخدم معظم الخلايا الليفية الجنينية بتركيز 20,000 خلية لكل ملليلتر. وللحصول على خلايا معزولة، تُترك الخلايا لتلتصق وتنتشر على التضاريس المؤقتة عن طريق التحضين عند 30 درجة مئوية لمدة 9.5 ساعة. بعد ذلك، يتم تقييم شكل الخلايا قبل الانتقال عن طريق سحب العينات وإجراء الصبغ والتصوير الفلوري لها.

تظهر هذه المادة فلورية ذاتية عبر معظم نطاق الأشعة فوق البنفسجية والنطاق المرئي، لذا يُوصى باستخدام الفلوروفورات الموجودة في الطرف الأحمر البعيد من الطيف، مثل Alexa Fluor 647، لتقليل الخلفية. ولتحفيز العينات على التعافي، انقل الطبق إلى حضانة بدرجة حرارة 37 degree Celsius واستمر في الزرع لمدة 19 ساعة؛ حيث يسمح ذلك للمادة بالتعافي وللخلايا بتكييف شكلها المورفولوجي مع التضاريس الجديدة. وبعد الحضانة، ضع الأصباغ المناسبة مثل phalloidin لتصوير الأكتين الخيطي.

كخطوة نهائية، يمكن تصوير الخلايا على التضاريس الجديدة الموضحة هنا، حيث يظهر تأثير ذاكرة الشكل أحادية الاتجاه للكتلة الناتجة عن معالجة واحدة لـ NOA 63. تكرر ذلك ثلاث مرات، حيث تشير النجمة إلى بداية المعالجة التجريبية. NOA 63 عبارة عن مادة صلبة زجاجية شفافة تتميز بخصائص ممتازة في ذاكرة الشكل.

في هذه الحالة، تمت معالجة المادة وأظهرت درجة انتقال زجاجي (TG) موحدة بلغت 51.1 °C كما تم تحديدها من بداية انخفاض معامل التخزين. ويحدث الانخفاض في الانفعال الملاحظ هنا عند درجة الـ tg المقاسة. وقد ثبتت نسبة كبيرة من الانفعال المطبق البالغ 4.7% بعد إزالة التحميل عند 20 °C، وهو ما يقابل نسبة تثبيت بلغت 89.3%. ثم استُعيد الانفعال المثبت بنسبة 84.4% ضمن نطاق درجة حرارة صغير نسبياً أثناء التسخين.

لم يظهر أداء ذاكرة الشكل أي تدهور حتى ثلاث دورات، كما يتضح من تتبع جميع المنحنيات لنفس المسار تقريبًا. وتتناقص سعة التضاريس المؤقتة بمرور الوقت عند درجة حرارة 30 degrees Celsius خلال 30 hours. عند درجة حرارة 30 degrees Celsius.

لقد انخفضت السعة بنسبة 50% تقريباً كما هو موضح هنا عند الزمن صفر. ثم تنخفض بنسبة 10% أخرى على مدار الساعات 9.5 التالية. وعندما يتم تحفيز الاستعادة عن طريق رفع درجة الحرارة إلى 37 درجة Celsius، تنخفض السعة إلى 0.5% من السعة الأولية خلال 9.5 ساعة بالنسبة للمكبس المستخدم وجهد كبس قدره 4.9 megapascals.

يتوافق هذا مع تغيير وظيفي من أخاديد بحجم 13 micrometer إلى سطح شبه مسطح. يستعيد هذا البوليمر شكله في نطاق درجة حرارة من 30 إلى 37 degrees تحت ظروف زراعة الخلايا. ويرجع ذلك إلى امتصاص الماء من وسط الزراعة، حيث يعمل الماء على تلدين البوليمر، مما يخفض tg، وهو ما يسمح بالاستعادة في درجات حرارة أقل من درجة TG الجافة البالغة 51 degrees.

يتمثل أحد الأمثلة على سلوك الخلايا الذي يتم التحكم فيه من خلال استخدام ركائز زراعة الخلايا النشطة في التغير في تنظيم الهيكل الخلوي على الركائز ذات الأخاديد المؤقتة. فقبل تحفيز عملية الاستعادة، تصطف خيوط الأكتين الدقيقة على طول اتجاه الأخاديد. أما بعد الاستعادة عن طريق زيادة درجة الحرارة، فإن الخيوط الدقيقة تكون قد أعادت تنظيم نفسها وأصبحت موزعة بشكل عشوائي.

وعلى العكس من ذلك، فإن عينات التحكم التي تحتوي على أخاديد مسطحة أو ثابتة لا تعيد تنظيم نفسها بعد زيادة درجة الحرارة. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هندسة غرفة المعالجة، ودرجة حرارة انتقال البوليمر، وطريقة تثبيت الانفعال، وتركيبة البوليمر نفسه، كلها عوامل يمكن تعديلها لتحقيق الانتقال المطلوب في تجربتك الخاصة عند اتباع هذا الإجراء. ويمكن استخدام طرق أخرى، مثل real time PCR، للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تغير التعبير الجيني استجابةً للتحفيز الميكانيكي من الركيزة بعد تطويرها.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الميكانيكا الحيوية الخلوية لاستقصاء الهيكل الخلوي، وإعادة الترتيب، وفيزياء المادة اللينة في بُعدين. نشكركم على اهتمامكم بعملنا وعلى مشاهدتكم.