كفاءة توصيل الجينات في الجهاز العصبي المركزي متعددة باستخدام الأراضي في الرحم Electroporation

الهدف العام من هذا الإجراء هو تغيير التعبير الجيني في الجهاز العصبي المركزي للجنين العصبي. ويتم تحقيق ذلك من خلال الحصول أولاً على إناث حوامل في توقيت محدد وتجهيزهن للجراحة. ثم يتم كشف القرون الرحمية عن طريق إجراء شق في البطن.

بمجرد كشف الأجنة، يتم حقن DNA في البطين الجانبي، أو البطين الثالث، أو الحيز تحت الشبكية. والخطوة النهائية من الإجراء هي تطبيق تيار كهربائي على الجنين عبر جدار الرحم، مع توجيه أقطاب التوصيل بحيث يوضع القطب الموجب فوق الموقع المفضل للترانسفكشن. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تكاثر وهجرة وتمايز السلائف العصبية في tline kelon dying kelon والشبكية من خلال مجهر التألق المناعي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل إنتاج الفئران المعدلة وراثياً، في كونها سريعة، وتسمح بدراسات ذات إنتاجية أعلى، وتكلفة أقل. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال التطور العصبي، مثل تحديد الجينات التي تنظم الخلايا العصبية السلفية، وتكاثر الخلايا، وتحديد مصير الخلية، والتمايز العصبي، وهجرة الخلايا. وقد تمتد آثار هذه التقنية نحو فهم أفضل للمسارات الجينية التي تكمن وراء العيوب في تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS)، والتي يؤدي الكثير منها إلى ضعف إدراكي واضطرابات سلوكية لدى البشر، وذلك بما يتجاوز فائدتها في فهم تطور الجهاز العصبي المركزي.

يمكن أيضاً تطبيق هذه التقنية على أنظمة عضوية أخرى مثل الجهاز العصبي المحيطي النامي، والقلب، والمشيمة. كما يمكن تطبيقها لدراسة نماذج الأمراض في الفئران، بالإضافة إلى كائنات نموذجية أخرى مثل الدجاج والـ xip. وبوجه عام، فإن العقبة الرئيسية التي تحول دون نجاح الأشخاص المبتدئين في هذه التقنية هي بقاء الأجنة على قيد الحياة؛ لذا يجب توخي الحذر عند التعامل مع الأجنة وحقنها وصبها.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما احتجنا إلى وسيلة سريعة للتحكم في التعبير الجيني في الجنين، والـ telencephalon، والشبكية. وقد طورنا هذه التقنية في مختبرنا من خلال تعديل التقنية التي وصفها Sal في البداية، والتي نُشرت في مجلة Developmental Biology في عام 2001. كما عملنا مع مختبر متخصص لترسيخ هذا البروتوكول في الـ dilon النامي أيضاً.

يعتبر العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الحقن والتثقيب الكهربائي يصعب تعلمها نظراً لأنها تتطلب تعاملاً دقيقاً للغاية مع الأجنة، كما أن مواقع الحقن قد تكون صغيرة جداً في بعض الأحيان، مثل الحيز تحت الشبكية. سيقوم راجيف، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبر شيرمان، بتوضيح الإجراء اليوم. للبدء، قم بتنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية. بعد ذلك، املأ المحاقن بمحلول ملحي ومحلول رينجر اللاكتات وضعها على وسادة تدفئة لتدفئتها في المنطقة الجراحية.

عقم وسادة تسخين باستخدام ethanol بتركيز 70%، ثم غطِّها بقطعة شاش معقمة غير وبرية. اضبط وسادة التسخين على 37 °C. ضع الحيوان في غرفة تخدير صغيرة وخدره عن طريق إعطاء isof fluorine بتركيز 5% مع الأكسجين بمعدل لتر واحد في الدقيقة عبر جهاز تبخير.

تأكد من تجميع عادم الإيزوفلورين باستخدام نظام سحب. وبمجرد أن يصبح تنفس الحيوان عميقاً ومنتظماً، أخرجه من الغرفة. استخدم اختبار قرص الأصابع وردود فعل رمش العين.

لضمان التخدير الكامل، ضع الحيوان المخدر على بطنه واستخدم أنبوب تنفس لإعطاء 2.25% من الفلورين أثناء الجراحة. احقن البوبرينورفين بتركيز 0.1 milligrams per kilogram من وزن الجسم تحت الجلد في قفا الرقبة.

استمر في مراقبة تنفس الحيوان وضبط تدفق isof fluorine إذا لزم الأمر. بعد ذلك، ضع شريطًا لاصقًا عبر صدر الحيوان المخدر وتحقق مرة أخرى من استجابة السحب عن طريق قرص القدم الخلفية بملقط غير مدبب. وباستخدام مسحة قطنية معقمة، وزع طبقة سميكة من de cream على البطن مع التأكد من تغطية الفراء السفلي بالكامل.

اترك الكريم لمدة ثلاث دقائق تقريبًا وتحقق بشكل متقطع من إزالة الشعر. وباستخدام مسحة معقمة، بلل وسادة شاش معقمة بماء معقم وامسح الشعر عن البطن. بعد ذلك، قم بتعقيم موقع الشق باستخدام الكلورهيكسيدين والمزيد من الماء.

قم بتجفيف منطقة البطن باستخدام شاش معقم ونظيف. كرر هذه الخطوة باستخدام ethanol بتركيز 70% مع استخدام شاش قطني معقم وجديد. استعد للجراحة بارتداء الزي الجراحي لكشف قرون الرحم.

أولاً، حدد موقع الخط الأبيض (linear alba) كخط باهت تحت الجلد عند الخط الناصف. وباستخدام الملقط، اسحب الجلد بعيداً عن جدار البطن واجرِ شقاً مستقيماً صغيراً من منتصف البطن إلى الأسفل باستخدام مقص الجلد وملقط ومقص منحنيين. كرر العملية مع البريتون. ثم أمسك البريتون باستخدام الملقط.

اسحب الأنسجة بعيداً ثم قم بعمل شق جراحي بحجم يكفي لسحب الرحم من خلاله. ضع شاشاً معقماً به شق رأسي صغير فوق الجرح وبلله بمحلول ملحي معقم ودافئ. بعد ذلك، أدخل الملقط في الشق وحدد موقع الرحم مع إبقاء الشق مفتوحاً باستخدام الملقط.

أمسك الرحم بين الجنينين الظاهرين الأول والثاني، ثم اسحب كلا جانبي قرني الرحم فوق الشاش. عُدَّ عدد الأجنة مع تدوين أي حالات امتصاص أو أجنة ذات حجم جسم صغير. ومن أجل تحضير العدد الصحيح من عمليات حقن DNA، بلل قرني الرحم بمحلول ملحي ثم أعد أحد قرني الرحم بعناية إلى التجويف البطني.

لتحميل الإبر الجراحية، استخدم ماصة سحب مزودة بقطعة فم لسحب 10 µL من محلول DNA خالٍ من السموم الداخلية بتركيز 3 mg/mL يحتوي على صبغة الميثيل الأخضر، ثم قم بتفريغ الـ DNA داخل الإبرة الجراحية. قم بتركيب الإبرة الأولى المملوءة على المجهر المتلاعب (micro manipulator).

قف بجانب المحقن بدءاً من الجنين الأقرب إلى المبيض. استخدم ملقطاً دائرياً لتدوير الجنين برفق داخل الساقط (decidua) بحيث يكون وجهه للأمام، مما يسمح بإجراء الحقن في اتجاه من اللفافة الرأسية السرجية (ROS roll) إلى الحبل السري. استخدم مصدراً ضوئياً بالألياف البصرية لتحديد الخط الناصف للدماغ الجنيني.

لاحظ البطينات الجانبية الكبيرة الموجودة على الجانبين في المناطق المنقارية. ثبّت الجنين في مكانه باستخدام ملقط منحني، وضع الإبرة الجراحية المعبأة فوق الرحم بحيث تكون زاوية الدخول إلى الدماغ 45 درجة تقريبًا. وبحركة سريعة وثابتة، أدر القرص الموجود في الملاعب الدقيق لإدخال طرف الإبرة عبر جدار الرحم وصولاً إلى البطين الجانبي لدماغ الجنين.

بعد ذلك، اضغط على دواسة المانع الدقيق. ولحقن محلول DNA، يمكن التحقق من نجاح عملية الحقن بسهولة من خلال ملاحظة انتشار صبغة الميثيل الأخضر (methyl green) في بطينات الدماغ الجنيني. والآن بعد حقن DNA، اسحب الإبرة ببطء إلى الأعلى لإزالتها دون التسبب في أي كسر.

ضع الجنين المحقون على شاش معقم وبلله جيداً بمحلول ملحي دافئ. أمسك الرحم بالقطب الموجب للقطب الكهربائي المسطح الموضوع فوق الموقع المطلوب لعملية transfection. ثم قم بتطبيق خمس نبضات كهربائية مربعة تتراوح بين 40 إلى 50 فولت ولمدة 50 ملي ثانية بمعدل نبضة واحدة في الثانية.

قم بتغطية الجنين الذي تم حقنه وعمل التثقيب الكهربائي له بشاش مبلل واقٍ، ثم انتقل لحقن الجنين التالي. عند الانتهاء من حقن وعمل التثقيب الكهربائي لجميع الأجنة المطلوبة في قرن الرحم، ادفعه بعناية إلى داخل تجويف الجسم. قم بإزالة قرن الرحم الثاني لبدء عملية الحقن والتثقيب الكهربائي للأجنة المتبقية.

بمجرد إعادة جميع الأجنة إلى داخل الرحم، أضف من 2 إلى 3 ملليلتر من المحلول الملحي الدافئ إلى التجويف البطني، ثم قم بإزالة الشاش من البطن للكشف عن جوانب الصفاق. استخدم خيط حرير أسود مضفر لخياطة الصفاق عن طريق تثبيت الخيط في الصفاق في المنطقة الأقرب إلى عظم القص، ثم المتابعة في الغرز بعيداً عن نقطة التثبيت. تأكد من أن جميع الغرز محكمة ومن عدم خياطة أي أعضاء داخلية أو جلد مع الصفاق.

قص خط الخياطة المتبقي وتخلص منه. اسحب الجلد لإغلاقه فوق خط الخياطة باستخدام ملقط مع استعمال دبابيس إغلاق الجلد. قم بتثبيت الجلد مع الحرص على عدم تدبيس خط الخياطة الموجود بالأسفل أو شد الجلد بقوة مفرطة.

بمجرد الانتهاء، تأكد من إحكام الدبابيس من خلال الضغط معًا برفق باستخدام أداة الخياطة هنا، حيث تم إدخال ناقل تعبير A-P-C-I-G الذي يحفز تعبير GFP في القشرة الحديثة النامية في المرحلة E 12 عن طريق التثقيب الكهربائي. ومع تقدم تطور القشرة الحديثة، تتمايز الخلايا السلفية القمية إما إلى خلايا سلفية قاعدية ثانوية أو عصبونات ما بعد الانقسام وتستمر في تعبير GFP. ويمكن بعد ذلك تحليل هذه الخلايا العصبية للكشف عن تعبير الواسمات النموذجية للنمط العصبي الفرعي الموضح باللون الأحمر.

في هذا المنظر البطني للدماغ الأمامي لجنين تم تعريضه للتثقيب الكهربائي في اليوم الجنيني E 12 وتشريحه في اليوم الجنيني E 14، يشار إلى موقع التثقيب الكهربائي عن طريق الفلورة فوق البنفسجية الخضراء بحلول اليوم الجنيني E 14. يظهر تعبير GFP في المهاد، وما قبل المهاد، وتحت المهاد، مما يشير إلى أن مناطق الـ dying lic قد تم نقل الجينات إليها بنجاح. ويحدد المربع المتقطع موقع المقطع العرضي عبر المنطقة البطينية.

يُظهر الفحص الدقيق للمنطقة البطينية هجرة خلايا GFP من المنطقة البطينية إلى المنطقة الستارية. كما يمكن إجراء التثقيب الكهربائي بسهولة في المنطقة التي ستتشكل فيها النوى الوطائية والشبكية الجنينية، كما هو موضح في هذا المقطع الإكليلي لجنين في اليوم E 16.5 تم تثقيبه كهربائياً باستخدام PCIC في اليوم E 15.5. هنا، يظهر تراكم الخلايا الموجبة لـ m cherry بشكل محدد في طبقة الخلايا العصبية الخارجية، ولا يُلاحظ في خلايا العقد الشبكية الموجبة لـ Brn3b في طبقة الخلايا العقدية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 30 دقيقة إذا لم تطرأ أي مضاعفات غير متوقعة.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام تقنيات التعقيم المناسبة، والحفاظ على ثبات اليد عند التعامل مع الأجنة، وتجهيز جميع المواد اللازمة قبل تخدير الأنثى الحامل. بعد هذا الإجراء، يمكن ترك الأجنة التي خضعت لعملية التضفير الكهربائي لتنمو حتى مرحلة البلوغ، وعند هذه النقطة يمكن إجراء طرق أخرى مثل المقاييس السلوكية والوظيفية للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بكيفية تأثير التلاعب بجينات معينة في الجنين على الوظيفة العصبية في البالغ. ومنذ تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS) لاستكشاف وظيفة الجينات داخل الجسم الحي (in vivo) في الفئران.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إدخال DNA غريب إلى الأنبوب العصبي الجنيني. وبشكل محدد، سنوضح لك كيفية تحضير أنثى حامل للجراحة، وكشف الرحم، وحقن DNA، وإجراء عملية الترحيل الكهربائي للجنين.

لا تنسَ أن العمل مع الفلور يمكن أن يكون خطيراً، ويجب اتخاذ احتياطات مثل استخدام نظام تخلص من الغازات (scavenging system) أثناء تنفيذ هذا الإجراء.