دراسة السن التي تعتمد على عدم الاستقرار الجيني باستخدام س. خميرة يفسبن الزمني النموذجي

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة عدم الاستقرار الجينومي المعتمد على العمر في الخميرة، وذلك من خلال الدمج بين العمر الزمني ومجموعة من فحوصات تلف الحمض النووي (DNA) والطفرات البسيطة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق أخذ عينات من مستنبتات الشيخوخة الزمنية كل يومين والتحقق من الحيوية عبر تشكيل وحدات تكوين المستعمرات أو CFU. وتتمثل الخطوة التالية من الإجراء في فحص طفرات الـ DNA عن طريق أخذ عينات من مستنبتات الشيخوخة وزراعة الخلايا على وسط انتقائي خاص بالطفرات.

وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات في طفرات DNA أثناء الشيخوخة الزمنية للخميرة من خلال تسوية نتائج اختبار الطفرات بالنسبة لمعدل البقاء على قيد الحياة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الشيخوخة، مثل الآليات التي تربط بين الشيخوخة وعدم الاستقرار الجينومي. لاختبار مدى الحياة الزمنية للخميرة أو CLS، قم أولاً بتلقيح مستعمرة خميرة واحدة في 1 mL من وسط الجلوكوز الاصطناعي الكامل، أو وسط SDC، ثم حضنها طوال الليل مع الرج عند 30 °C. وفي اليوم التالي، خفف المزرعة التي حُضنت طوال الليل في 10 mL من وسط SDC الطازج لتصل قيمة OD 600 إلى 0.05 أو 0.1، ثم حضنها مع الرج عند 30 °C لمدة ثلاثة أيام.

في اليوم الثالث، وعندما تكون الخلايا في طور الثبات، خفف كل عينة Eloqua بمقدار 10,000 مرة في ماء معقم بجهاز الأوتوكلاف، ثم اسحب عليقين بحجم 10 µL من القارورة وازرع 10 µL من كل مزرعة مخففة على طبق A-Y-E-P-D. حضن الطبق عند 30 °C حتى تظهر المستعمرات. ويُعتبر عدد المستعمرات الناتجة أو الوحدات المكونة للمستعمرات من مزرعة اليوم الثالث بمثابة بقاء بنسبة 100%.

استمر في سحب حصص من المزرعة الهرمة في الأيام التالية لغرض الزراعة. يتم تعديل عوامل التخفيف وفقاً لذلك لضمان ظهور حوالي 20 إلى 100 مستعمرة في مقايسة CFU. يتم إيقاف عملية أخذ العينات عندما تنخفض حيوية المزرعة إلى أقل من 1%، وهو ما يحدث عادةً بين اليومين 11 و13؛ كما يمكن دراسة حيوية الخلايا في الخلايا التي تم تعتيقها على الأطباق.

لبدء هذا المقايسة، يتم تلقيح مستعمرة واحدة في واحد ملليتر من وسط جلوكوز اصطناعي كامل، والحضن طوال الليل مع الرج عند 30 درجة مئوية. عندما تصل كثافة المزرعة إلى حوالي 10⁸ خلية لكل ملليتر، يتم تخفيف المزرعة باستخدام ماء معقم بالـ autoclave إلى 100 إلى 200 خلية لكل 10 µL و1000 خلية لكل 10 µL. ولكل سلالة، يتم تحضير مجموعة مكونة من 8 إلى 20 طبق SDC خالية من التريبتوفان، مع وضع علامات عليها وفقاً لكثافة التلقيح.

لضمان إمكانية عدّ 10 إلى 100 مستعمرة تحسباً لانخفاض الحيوية أثناء التعتيق، يتم توزيع حصتين مقدار كل منهما 10 إلى 30 µL من المزرعة المخففة على كل طبق. تُحضن مجموعة الأطباق عند 30 °C طوال فترة تحليل مدة البقاء؛ وفي يوم التوزيع وكل يومين بعد ذلك، يتم إخراج طبق واحد وإضافة 0.5 mL من التربتوفان قطرة تلو الأخرى للسماح للخلايا الحيوية بالنمو. يُحضن الطبق عند 30 °C لمدة إضافية تتراوح من 48 إلى 72 ساعة.

بعد مرور 48 إلى 72 ساعة، يتم عد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) لتقييم الحيوية في يوم إضافة التربتوفان، وذلك لفحص تلف الحمض النووي DNA وتكرار الطفرات أثناء الشيخوخة الزمنية. يتم استنبات عدد من السلالات ذات الخصائص الخاصة بالتوازي مع السلالة البرية (wild type) لاختبار CLS في الخميرة.

يمكن تقييم تردد الطفرات التلقائية عن طريق قياس تردد مقاومة L-Canavanine في مزرعة تمر بمرحلة الشيخوخة الزمنية. تؤدي الطفرات في جين can1، الذي يشفر بروتين نفاذية الأرجنين في الغشاء البلازمي، إلى جعل الخلايا مقاومة لنظير الأرجنين L-Canavanine. ستنمو الخلايا المقاومة لـ L-Canavanine على أطباق وسط اصطناعي كامل (Synthetic complete medium) خالية من الأرجنين ومدعمة بـ L-Canavanine sulfate. كما يتيح قياس تردد الارتداد الإيجابي لـ trip في سلالة تحتوي على طفرة كهرمانية (amber mutation) في تسلسل تشفير trip.1 تقدير معدل استبدال القواعد خلال الشيخوخة الزمنية للخميرة.

ستنمو خلايا الارتجاع الإيجابي على أطباق خالية من التريبتوفان. تحمل السلالة السالبة لـ lyse EH150 إزاحة بمقدار +4 في إطار القراءة المفتوح، مما يؤدي إلى ضمور في تخليق اللايسين، ويمكن عكس ذلك عن طريق طفرات إدخال أو حذف صغيرة. سيتم اختيار الخلايا المرتجعة على أطباق خالية من اللايسين للكشف عن إعادة الترتيب الكروموسومي الواسع أو gcr.

تُستخدم سلالة طافرة يتم فيها تعطيل HX T 13 الموجود على بعد 7.5 كيلوباعدة تيلوميرياً من can one على الكروموسوم الخامس بواسطة كاسيت U three؛ وتجعل الطفرات في كلا الجينين can one وU three الخلايا مقاومة لـ L Canavan وحمض five fluoro orotic على التوالي. وبما أن تردد الطفرات النقطية التي تحدث في كلا الجينين منخفض، فإن تحليل تردد المقاومة لكل من El Canavan وحمض five fluoro orotic يوفر تقديراً لـ gcr لمراقبة مستوى إعادة التركيب المتماثل وغير المتماثل. وخلال الشيخوخة الزمنية، يتم توليد طفرات تحمل إما تكرارات معكوسة متماثلة بنسبة 100% أو متماثلة بنسبة 91%.

يسمح إعادة الاتحاد في موقع IRS at the his three بإنتاج بروتين his three وظيفي. وبناءً على ذلك، فإن الخلايا التي حدث فيها إعادة الاتحاد ستنمو على أطباق خالية من الهيستيدين ومدعمة بالجالاكتوز. وفي اليوم الثالث، عندما تصل الخلايا إلى طور الثبات، سيتم سحب كمية مناسبة من الخلايا من كل مزرعة شيخوخة.

بما أن الإجراء نفسه يُستخدم لجميع المقاييس، سيتم معالجة عينة واحدة فقط. ولأغراض هذا الفيديو، قم بترسيب الخلايا عن طريق تدويرها في جهاز طرد مركزي مكتبي. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 1 mL من ماء الأوتوكلاف.

مرة أخرى، قم بإزالة الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 100 microliters من الماء، ثم وزع الخلايا على الأطباق المناسبة لاختيار المرتدات المطلوبة. قم بحضن الأطباق عند 30 degrees Celsius، وبعد ثلاثة إلى أربعة أيام قم بعدّ CFUs، حيث يتم تطبيع تردد الطفرة بالنسبة لعدد الخلايا القابلة للحياة. يوضح هذا الرسم البياني نتائج تمثيلية من اختبار نموذجي للعمر الزمني عند مقارنة البقاء الزمني للخلايا من النوع البري مع خلايا الطفرات S CH nine delta TOR one delta و RAs two delta.

في المزارع السائلة، تظهر الطفرات التي تفتقر إلى TOR one s، أو CH nine، أو RAs two عمراً زمنياً ممتداً. علاوة على ذلك، يظهر النقص في s CH nine وRAs two تأثيراً تآزرياً في تعزيز طول العمر والبقاء الزمني في وجود مصادر كربون مختلفة. ويظهر استخدام مقايسة حيوية NC two في الرسم البياني التالي.

في اليوم الأول، تم تخفيف مزارع النوع البري من SDC وزراعتها في أطباق SC trip dropout خالية من مصدر الكربون. تم تحضين أطباق SC Tripp dropout المكملة بالجلوكوز أو الإيثانول أو الجلسرول عند 30 °C كل يومين. تم استرجاع طبق واحد من كل مجموعة وإضافة العناصر الغذائية المناسبة للسماح بالنمو وتكوين المستعمرات.

يختلف تكرار الطفرات المعتمد على العمر بشكل كبير اعتماداً على السلالة، والخلفية الوراثية، والتعديل الجيني، والمزرعة، والظروف، والعمر. يوضح هذا الجدول النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها في سلالة من النوع البري. وتظهر النتائج الممثلة لتخليق ما وراء الآفة في الصورة التالية.

قد تنطوي الزيادة في تردد الطفرات المعتمدة على العمر على تغيرات في إصلاح الحمض النووي الخاطئ باستخدام المستخلصات النووية وقوالب الحمض النووي المختلفة. يمكننا تقييم تخليق الترجمة أو TLS في الخلايا المتقدمة في السن زمنياً. تم تحليل المستخلصات النووية من خلايا النوع البري، وخلايا طفرة SCH nine delta، وخلايا في طور السكون عمرها ثلاثة أيام.

يُشار إلى نواتج TLS ذات القالب غير التالف بخطوط متصلة، بينما يُشار إلى نواتج TLS ذات القالب التالف بخطوط منقطة. لم يُلاحظ وجود تخليق عبر الآفة في المستخلصات النووية من طفرة s CH nine delta طويلة العمر، ويُشار إلى البادئات الحرة بالسهم المفتوح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل العمر الزمني وطفرات DNA في الخميرة.