تطبيق الربط الدائم الشريان المخي الأوسط في الماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة نقص التروية الدماغية البؤري في النماذج الحيوانية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء شق صغير في الجلد بين العين اليسرى وقاعدة الأذن. بعد ذلك، يتم إجراء عملية فتح الجمجمة عند نقطة التقاء القوس الوجني والعظم القشري للكشف عن الشريان الدماغي الأوسط، ثم يتم ربط الشريان الدماغي الأوسط باستخدام جهاز كي للأوعية الصغيرة.

أخيراً، يتم خياطة الجلد لإغلاق الجرح. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر وجود احتشاء يقع في نصف الكرة المخية الأيسر لدماغ الفأر. كما يمكن صبغ الدماغ باستخدام TTC أو فحصه باستخدام MRI لتصور السكتة الدماغية.

يمكن أيضاً استخدام دماغ المصاب بالسكتة الدماغية لتحديد تعبير البروتين أو mRNA. مرحباً، أنا Garza Chola، طالبة دراسات عليا في مختبر Gale Johnson بجامعة Rochester.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال السكتة الدماغية، مثل توضيح الآليات التي تؤدي إلى موت الخلايا في الدماغ الإقفاري. وللتحضير للجراحة، يتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية، والإسفنج الشاش، والمطبقَات المعرفية باستخدام الموصدة (autoclave). تُحفظ الأدوات الجراحية في ethanol 70% أثناء الجراحة، وتُجفف بالهواء على شاش معقم مباشرة قبل الاستخدام.

قم برش منطقة العمل بـ 70%ethanol قبل ساعتين من الجراحة. احقن الفأر بـ 0.05 milligrams per kilogram من buprenorphine. يتم إعطاء الدواء مرة أخرى فور انتهاء الجراحة، ثم كل ثلاث إلى خمس ساعات خلال فترة الـ 24 hour الأولى بعد العملية الجراحية.

استخدم مبخرًا للتخدير لتخدير الفأر باستخدام خليط غاز يتكون من 3% ISO fluorine و 20% oxygen. اضبط كمية الأكسجين باستخدام مقياس التدفق. اختبر مستوى التخدير عن طريق قرص إصبع القدم أو الذيل.

يتم الحفاظ على مستوى التخدير باستخدام 2% ISO fluorine. تُوضع الدموع الاصطناعية في عيني الفأر مع توخي الحذر لتجنب إتلاف العين أثناء الإجراء الجراحي.

ضع الفأر على جانبه الأيمن في وضعية جانبية باستخدام مقصات حلاقة الحيوانات. احلق المنطقة الموجودة على الجانب الأيسر بين العين اليسرى وقاعدة الأذن اليسرى. طهر المنطقة بالتناوب بين محلول Betadine والإيثانول بتركيز 70% باستخدام مسحات قطنية وفرك المنطقة برفق.

من الضروري تكرار العملية. ضع الفأر على وسادة تدفئة متصلة بمسبار شرجي؛ وللحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة Celsius، أدخل المسبار الشرجي باستخدام الزيت المعدني. ضع الفأر على جانبه الأيمن تحت المجهر وثبته باستخدام شريط لاصق.

قم بقص نافذة في إسفنجة شاش وغطِّ المنطقة الجراحية باستخدام مقص مستقيم دقيق. قم بإجراء شق عمودي بين العين اليسرى وقاعدة الأذن اليسرى. استخدم ملاقط مرقئة منحنية لإبقاء المنطقة الجراحية مفتوحة في حال حدوث جفاف مفرط للأنسجة أثناء الجراحة.

استخدم مسحات قطنية لوضع محلول PBS المعقم. استخدم مقصاً نابضاً لإجراء شق أفقي في العضلة الصدغية، ثم اسحب ببطء باستخدام الملقط لفصل العضلة الصدغية قليلاً عن الجمجمة. ثبت عظم الفك باستخدام ملقط منحني، واستخدم إبرة قياس 18 gauge لإجراء عملية بضع قحف صغيرة تحت منطقة الصدغ عند نقطة التقاء القوس الوجنية والعظم القشري.

باستخدام مقص العظام، يزيل الباحثون قطعاً صغيرة من الجمجمة للكشف عن الشريان السباتي الأوسط (MCA). يجب عدم إتلاف القوس الوجنية ومحتويات المدار خلال هذه العملية. وباستخدام كيّ صغير للأوعية، يتم ربط الجزء القاصي من الشريان السباتي الأوسط (MCA)، ثم تُعاد العضلة الصدغية إلى وضعها الأصلي، وتُستخدم خيوط نايلون بمقاس 5-0.

لإغلاق موقع الشق، أوقف التخدير وأزل المسبار الشرجي. احقن الفأر بجرعة ثانية من buprenorphine تحت الجلد. أعد الفأر إلى القفص الذي تم الحفاظ عليه عند درجة حرارة 37 °C.

باستخدام لوحة تدفئة. راقب الفأر بدقة خلال الـ 24 ساعة القادمة لرصد أي علامات عدم ارتياح، بما في ذلك انخفاض الشهية أو استهلاك الماء، أو اتخاذ وضعية الانحناء، أو زيادة معدل التنفس، أو وقوف شعر الجسم. قدم للفأر هلام الاستشفاء مباشرة بعد الجراحة.

انتظر لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات بعد الجراحة. ثم احقن الفأر بـ buprenorphine تحت الجلد كل ثلاث إلى خمس ساعات لمدة تصل إلى 24 ساعة. وبعد 24 ساعة من الجراحة، قم بتخدير الفأر تخديرًا عميقًا ثم قم بإجراء تروية للفأر باستخدام 4%TTC.

قم بإزالة الدماغ ووضعه في محلول paraform aldehyde بتركيز 4% طوال الليل. وفي اليوم التالي، ثبت الدماغ في كتلة التقطيع. استخدم شفرات حلاقة لتقطيع الدماغ إلى شرائح بسمك 1 mm.

ضع الشرائح بجانب مسطرة قياس مليمترية. وباستخدام كاميرا رقمية متصلة بمجهر تشريحي، قم بتصوير الشرائح باستخدام برنامج image J.

انقر على قائمة الملف (file) وافتح الصورة المطلوبة. انقر على علامة تبويب الخط المستقيم في البرنامج. ارسم خطاً مستقيماً بين الحافتين على المسطرة.

انقر على قائمة التحليل (analyze) واختر تعيين المقياس (set scale). حدد المسافة المعروفة بقيمة one ووحدة الطول بـ millimeter. انقر على علامة تبويب الدائرة الحرة (freehand circle).

ارسم دائرة لتحديد نصف الكرة المخي المقابل. انقر على قائمة التحليل (analyze) واختر قياس (measure). ستظهر نافذة الحسابات التي تعرض مساحة الدائرة المرسومة.

ارسم دائرة أخرى حول النصف الكروي المماثل، مع استبعاد منطقة الخط الأبيض. قم بقياس المساحة كما هو موضح سابقاً. ستتم إضافة القيمة الجديدة إلى نافذة الحساب.

يمثل الفرق بين القيمة الأولى والقيمة الثانية مساحة الاحتشاء. احسب مساحة السكتة الدماغية في كل شريحة من خلال تكرار الخطوات المذكورة أعلاه لسماكة شرائح تبلغ 1 mm. ثم احسب حجم السكتة الدماغية عن طريق جمع مساحة السكتة الدماغية المحسوبة في كل شريحة.

يوضح هذا الشكل صبغة TTC للدماغ بعد 24 ساعة من ربط الشريان المخي الأوسط (MCA) الدائم في فأر من نوع C 57 BL six البري. يظهر موقع السكتة الدماغية باللون الأبيض، ويمكن رؤيته من خلال تكبيرات وزوايا مختلفة. تظهر هنا شرائح بسمك 1 mm من دماغ مصاب بسكتة دماغية مصبوغ بـ TTC، من الجزء الأمامي إلى الجزء الخلفي من الاحتشاء.

تم حساب الحجم بعد 24 ساعة من الجراحة. يبلغ حجم الاحتشاء حوالي 23 cubic millimeters بمجرد القياس. يمكن إنجاز هذه التقنية في غضون 30 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

شكراً للمشاهدة.