التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الجزيئات الحيوية مثل DNA والبروتينات في محاليل منظمة مائية في الوقت الفعلي باستخدام مجهر القوة الذرية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير الجزيئات الحيوية المراد تصويرها أولاً، ثم إعداد مجهر القوة الذرية وتحديد موضع مسبار عارضة FM.

بعد ذلك، يتم تصوير وتحليل سطح العينة والجزيئات الحيوية المستهدفة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح الحجم العام وكمية وتنظيم DNA والبروتينات والمعقدات الجزيئية الحيوية غير المتجانسة في ظروف منظّمة باستخدام مجهر القوة الذرية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المرافقات الجزيئية، مثل ما هي هندسة STO لمعقدات المرافقات والمرافقات المساعدة مع العميل.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيداً لأن خطوات تحضير مسبار AFM وذراع Kent قد يصعب تعلمها من التعليمات المطبوعة، ويرجع ذلك بشكل كبير إلى التعقيدات المرتبطة بالتعامل المادي معها. سيقومMorgan Shannon وJohn Gertz، وهما طالبان من مختبري، باستعراض هذا الإجراء. للبدء، قم بعزل جزيئات البروتين أو DNA المراد تصويرها وقم بتعليقها في محلول منظم مائي. بعد التأكد من نقاء العينة، قم بحضنها في محلول منظم للامتصاص الخاص بـ AFM على الثلج لتعزيز التصاق العينة بالميكا.

بالنسبة لعينات البروتين، استخدم محلول "heaps" المنظم بتركيز 10 millimolar. أما بالنسبة لـ DNA، فإن المحلول المنظم الذي يحتوي على المغنيسيوم والمكون من 10 millimolar tris بأس هيدروجيني pH 7.5 و10 millimolar كلوريد الصوديوم و2 millimolar كلوريد المغنيسيوم يعد مناسباً لتركيب مسبار AFM. ضع حامل مسبار الخلية السائلة في محطة تثبيت الرافعة المقابلة.

حدد موقع الكابول الطويل والسميك لمسبار الرافعة من نيتريد الحاد الذي سيتم استخدامه في التصوير. انقله بعناية إلى حامل مسبار الخلية السائلة، مع التأكد من بقاء الرأس في وضع عمودي. بعد ذلك، افحص الكابول تحت مجهر ضوئي للتأكد من سلامته واستقراره بشكل صحيح في حامل مسبار الخلية السائلة.

بعد ذلك، قم بإزالة رأس a FM بعناية من مجموعة تعشيق الأداة عن طريق إحكام ربط برغي مشبك الرأس العصبي. اقلب رأس a FM وادفع حامل مسبار الخلية السائلة بقوة فوق الدبابيس الأربعة الموجودة في قاعدة رأس a FM. وأخيراً، أعد رأس a FM بعناية إلى مجموعة تعشيق الأداة.

للمزيد من تحضير مجهر القوة الذرية (FM) قبل تصوير العينات، حرك مقابض المجهر الضوئي المدمج لتحديد موقع طرف العتلة، ثم اضبط أسهم الأعلى والأسفل في وحدة التحكم بالبصريات عبر البرنامج لجعل طرف العتلة في بؤرة التركيز. استخدم مقابض ضبط الليزر لمحاذاة الليزر مع طرف العتلة. وتعد هذه إحدى أكثر الخطوات تحدياً من الناحية التقنية في البروتوكول، حيث يتم تحديد الموضع يدوياً ويتطلب ضبطاً دقيقاً للمقابض.

تزيد المراقبة الدقيقة لليزر في نقطة الانعكاس ونقطة الإضاءة من احتمالية نجاح عملية المحاذاة. بعد ذلك، قم بضبط مقابض الكاشف الضوئي في رأس الـ AFM لتمركز الكاشف الضوئي. ضع شريحة ميكا مكسورة حديثاً ومثبتة على قرص عينة AFM معدني على حامل العينات الممغنط الموجود أعلى لوحة حامل الـ AFM.

قم بتدوير لوحة حامل الـ FM بحيث يكون قرص العينة في الموضع المناسب للتصوير الأولي. استخدم التحكم في سطح التركيز (focus surface control) في برنامج الجهاز لتحريك رأس الـ FM لأسفل باتجاه سطح قرص عينة الـ MICA. اختر أيقونة الضبط (tune icon) من برنامج الجهاز وقم بضبط الكابول (cantilever)، وذلك حتى تصبح المعالم المتميزة على سطح الـ MICA أو انعكاس الطرف في حالة تركيز.

يتراوح تردد الرنين للمجسات الموصى بها من نوع MSNL أو SNL بين 20 و60 kilohertz. اختر إزاحة ذروة بنسبة 5% لتصوير عينة MICA. أولاً، قم بتثبيت المجس على سطح MICA، واضبط حجم المسح الأولي على 10 micrometers ومعدل المسح على one hertz.

التقط صور مسح كاملة للمجال الذي تبلغ مساحته 10 ميكرومتر. بعد ذلك، قلل حجم المسح إلى 5 و 0.5 ميكرومتر والتقط صوراً كاملة لكل مجال. قم بفصل المسبار بالنقر مرة واحدة على أيقونة الفصل في برنامج الجهاز.

لتصوير الجزيئات الحيوية المستهدفة، اخلط 5 µL من العينة المحضرة مع 45 µL من محلول الامتصاص المنظم الطازج. أضف بعناية 50 µL من المحلول الذي يحتوي على الجزيئات الحيوية بتركيز 0.5 µg/mL مباشرة على سطح MICUs. انتظر لمدة خمس دقائق للسماح للجزيئات الحيوية في العينة بالالتصاق بسطح الميكا.

بعد ذلك، اسحب بواسطة الماصة من 50 إلى 100 µL إضافية من محلول الامتصاص المنظم في حامل مسبار الخلية السائلة. ومع توخي الحذر لعدم لمس المسبار، أو رأس FM، أو MICA بطرف الماصة، قم بإعادة ضبط الكاشف الضوئي ومحاذاة الليزر مع العارضة (cantilever) حسب الضرورة. ثم استخدم برنامج الجهاز لإعادة تفعيل المسبار.

قم بزيادة حجم المسح لتحديد المناطق ذات الأهمية. وبمجرد اكتمال التصوير، انقر على أيقونة السحب في برنامج الجهاز عدة مرات لفصل المسبار. وأخيرًا، استخدم الماء المقطر لشطف حامل مسبار الخلية السائلة وقرص العينة جيدًا.

ثم جرب ذلك باستخدام الهواء المضغوط. يظهر هنا مثال على صورة A FM. توفر ركيزة الميكا سطحاً مسطحاً جزيئياً يمكن لـ DNA والبروتين الامتصاص عليه.

يوفر تصوير مادة MICA قبل عينات الجزيئات الحيوية ضابطاً سالباً وتقييماً لضوضاء التصوير. كما يوفر مستوى من التأكيد بأن الكابول (cantilever) قد تم ضبطه بشكل صحيح وأن تصوير العينة اللاحق سيكون ناجحاً. ويمكن التعرف بسهولة على الحمض النووي DNA البلازمي مزدوج السلسلة الذي يُفترض أنه ملتف فائقاً من خلال مظهره غير المتماثل وترسبه المنتظم على ركيزة Micah التي كانت خالية من أي ميزات مسبقاً.

كما يمكن تمييز المعقدات البروتينية ذات الأحجام الجزيئية المنفصلة بشكل فريد عن ركيزة الميكا. وتشير الاختلافات في حجم الجسيمات إلى عدم تجانس العينة، ويمكن أن تكون مفيدة في تقدير الهندسة القياس البروتينية أو النشاط البيوكيميائي. وقد لوحظ الشكل القطري العام والتوجه المتسق للجسيمات البروتينية.

هذا مثال على خلل تصويري (imaging artifact)، حيث من المتوقع أن تكون البروتينات موجهة على ركيزة ميكا (Micah substrate) بشكل عشوائي. قد تعود الأسباب المحتملة لهذا الخلل الملاحظ إما إلى شذوذ في السن الفيزيائي أو إلى إجراء تصوير بقوة الذرة (AFM) بمعدل مسح سريع للغاية، بينما يمنع تداخل السن (tip convolution) حسابات قياس الطول المطلقة في المحورين x و Y؛ ومع ذلك، قد تظل قياسات الارتفاع في المحور Z والقياسات النسبية للمحورين X و Y مفيدة لتقدير الخصائص الفيزيائية الحيوية للجزيئات الحيوية المصورة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضبط ذراع الارتكاز (cantilever) بدقة ومحاذاة الكاشف الضوئي باتباع هذا الإجراء الأساسي لتصوير AFm.

يمكن إضافة خطوات أخرى، بما في ذلك استخدام خلية سائلة لتبادل المحلول المنظم، بهدف الإجابة على أسئلة إضافية مثل قدرة المرافقات الجزيئية على التأثير في تحرير مستقبلات الستيرويد من عناصر الاستجابة للحمض النووي DNA الخاصة بها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية تصوير بروتينات DNA والمعقدات الجزيئية الحيوية باستخدام مجهر القوة الذرية في ظروف منظمة.