الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام مقايسة تثبيط بشرية في المختبر لقياس وظيفة الخلايا التائية التنظيمية (treg) والتنبؤ باحتمالية فقدان وظيفتها مستقبلاً. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير واختبار حبيبات مشفرة أولاً، والتي ستُستخدم كمحفزات خلوية. والخطوة الثانية هي عزل خلايا تائية ساذجة نقية CD4+ CD25-، وخلايا تائية CD4+ CD25-low منشطة في الجسم، وخلايا تائية تنظيمية CD4+ CD25+ high، بالإضافة إلى خلايا أحادية النواة في نخاع العظم (BMCs) المشععة من البنكرياس لاستخدامها كخلايا عارضة للمستضد (APCs).

بعد ذلك، يتم إعداد مستنبتات فردية من الخلايا التائية الساذجة أو المنشطة كخلايا مستجيبة، مع استخدام خلايا PBMC كخلايا عارضة للمستضد (APCs)، أو يتم إجراء مستنبتات مشتركة تحت نفس الظروف، ولكن مع إضافة الخلايا التائية التنظيمية (tregs) بنسبة 1 إلى 10. وتتمثل الخطوة النهائية في حصاد الخلايا وقياس تكاثرها عن طريق دمج الثيميدين المسمى بالتريتيوم. ويمكن للنتائج التي يتم الحصول عليها في النهاية أن توضح الفروقات في تثبيط استجابات الخلايا التائية الساذجة مقابل الخلايا التائية المنشطة داخل الجسم.

اسمي جيف وودكليف. لا تعبر الخلايا التائية التنظيمية عن علامات سطحية خلوية فريدة، لذا، ومن أجل قياس وظيفتها بشكل موثوق، يجب عزلها باستخدام تقنيات تمنح أفضل فصل ممكن.

تتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة مقارنة بالطرق الأخرى مثل العزل المغناطيسي في أن فرز الخلايا المنشط بالفلورة يوفر مجموعات خلوية نقية للغاية. ومن ثم يمكن اختبار وظيفة الخلايا بشكل موثوق في مقايسات التثبيط في المختبر كما هو موضح هنا. ومع ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية حول وظيفة خلايا treg في الأشخاص الأصحاء والمصابين بمرض السكري من النوع الأول. كما يمكن تطبيقها على أمراض مناعية ذاتية أخرى مثل التهاب المفاصل الروماتويدي البشري، والذئبة الحمامية الجهازية، والتصلب المتعدد، وغيرها. لطلاء الخرز المنشط بـ anti-human CD three.

أضف 1 mL من خرزات M four 50 toil المنشطة من القارورة الأصلية إلى أنبوب سعة 1.5 mL، وضع الأنبوب في حامل مغناطيسي حتى تلتصق جميع الخرزات بجدار الأنبوب. بعد ذلك، قم بإزالة محلول تنظيم الخرز عن طريق سحبه باستخدام الماصة بينما لا يزال الأنبوب في الحامل المغناطيسي. ثم أخرج الأنبوب من الحامل المغناطيسي وأضف 1 mL من محلول التنظيم الأول (buffer one).

ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي بشكل متكرر. قم بإزالة المحلول المنظم بينما لا يزال الأنبوب في الحامل المغناطيسي. أعد تعليق الحبيبات في 1 mL من المحلول المنظم رقم واحد مرة أخرى.

في هذه المرحلة، يتم إضافة 40 µL من الجسم المضاد anti-human CD3 أيضاً. تُرجّ الخرزات والأجسام المضادة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، يتم إضافة 0.1%weight per volume BSA، ويستمر الرج لمدة 16 ساعة تالية.

بعد ذلك، اغسل الحبيبات مرتين باستخدام المنظم الثاني عن طريق تحضين الحبيبات في 1 mL من المنظم الثاني لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 2 إلى 8 °C، ثم قم بإزالة المنظم بينما يوضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي. ثم اغسل الحبيبات مرة إضافية تحت نفس الظروف المعقمة.

باستخدام 1 mL من المنظم 3 هذه المرة، اختبر كفاءة طلاء الأجسام المضادة عن طريق إضافة عدد متغير من الخرزات المطلية بـ CD3 لكل خلية من أجل تحديد النسبة المثلى، مع وضع 50,000 من خلايا PBMC في كل بئر في ثلاث نسخ مكررة في طبق 96 بئراً. بعد 72 ساعة من الزرع عند 37 °C، أضف 1 µCi من الثيميدين المسمى بالتريتيوم وواصل التحضين لمدة 16 ساعة تالية. قم بحصد الخلايا في طبق حصاد متعدد الشاشات أو ما شابه.

أضف سائل الوميض واقرأ عدد النبضات في الدقيقة أو CPM لكل بئر. باستخدام عداد وميض من نوع top count N XT أو ما شابهه، حدد نسبة الخرزات إلى الخلايا باستخدام النسبة التي تعطي CPM أعلى من 5,000 باستمرار، ولكن أقل من 15,000 وفقاً لخبرتنا. وعادة ما تعطي نسبة ثلاث خرزات لكل خلية التحفيز الأمثل لكل من الخلايا المستجيبة وخلايا treg في جميع الأشخاص البشريين الذين تم اختبارهم.

املأ أنبوباً مخروطياً سعة 50 milliliter بكمية 15 milliliters من fal plus. ثم قم بإجراء تخفيف بنسبة واحد إلى ستة لـ 50 milliliters من الطبقة الكريمية (buffy coat) عن طريق إضافة 250 milliliters من PBS إلى أنبوب الدم. أضف ببطء 25 milliliters من الطبقة الكريمية المخففة فوق fial pack مع الحرص على عدم زعزعة الطبقات.

قم بإجراء الطرد المركزي عند 800 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. مع إيقاف تشغيل المكابح، اجمع بعناية طبقة PBMC، وهي الطور المتوسط الأبيض الموجود بين fial والمحلول المنظم. إذا لزم الأمر، قم بكشط الخلايا من جدار الأنبوب.

انتظر لبضع دقائق وقم بجمعها من المرحلة المتوسطة مرة أخرى. انقل الخلايا إلى أنابيب جديدة سعة 50 milliliter واغسلها عن طريق ملء الأنابيب بـ PBS pellet. الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs).

كرر خطوة الغسيل مرتين في كل مرة. قم بدمج كرتين من الخلايا في أنبوب واحد، ثم ادمج في النهاية جميع كرات الخلايا في أنبوب واحد سعة 50 milliliter. بعد ذلك، استخدم 20 microliters من الخلايا المعلقة لتحديد حيوية الخلايا عن طريق استبعاد tripan blue.

قم بتوليد APCs تجريبية عن طريق نقل 1 mL من pbmc الحيوية إلى أنبوب جديد. ثم أضف 4 mL من الوسط الغذائي وعرض الخلايا للإشعاع بجرعة 5,000 rads، ثم أكمل ملء الأنبوب الذي يحتوي على بقية P BMCs بمحلول PBS المنظم. بعد ذلك، قم بتدوير الخلايا بسرعة 250 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، ثم اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 4 mL من المزيج نفسه.

أضف بعد ذلك 200 µL من max anti CD four microbeads إلى pbmc، ثم قم بتحضين خليط الخلايا والخرزات عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. وبعد انتهاء التحضين، اغسل الخلايا باستخدام 40 mL من منظم PBS، ثم قم بترسيب الخلايا. بعد ذلك، صب السائل العلوي وأعد تعليق الخلايا في 8 mL من منظم Degas PBS في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، استخدم مرشحات الفصل المسبقة لترشيح وتعزل معلق الخلايا. ثم قسّم معلق خلايا الدم الطرفية (PBM CS) إلى أنبوبين سعة 15 milliliter. وأضف 4 milliliter من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (P BMCs) إلى كل أنبوب.

قم بتثبيت عمودين سميكين في فاصل مينيماكس (minimax) وضع أنابيب تجميع أسفل كل عمود. ثم أضف 3 mL من منظم DGAs PBS إلى كل عمود، وعندما ينفد المنظم، قم بسكب كامل محلول الخلايا البالغ 4 mL من كل أنبوب فوق الأعمدة قبل أن ينفد معلق الخلايا تماماً. أضف 3 mL من منظم DGAs PBS في درجة حرارة الغرفة إلى كل عمود واترك المنظم يتدفق إلى أنابيب التجميع.

أضف المزيد من المحلول المنظم حتى يخرج سائلاً رائقاً. اسحب خمسة ملي لترات إضافية من محلول DGAs المنظم باستخدام الماصة وضعها على أعمدة LS، ثم قم بإزالة أعمدة LS من فاصل minimax. ضع الأعمدة في أنابيب تجميع جديدة معقمة سعة 50 ملي لتر.

اسمح بنزول نصف ملليلتر ثم ادفع ببطء بقية الحجم للخارج، وهو ما يقارب 4 ملليلتر. الآن، ادمج الكسرين الإيجابيين لـ CD4. بعد ذلك، أضف ما يصل إلى 50 ملليلتر من PBS إلى الأنبوب وقم بعدّ الخلايا بعد طردها مركزياً عند 400 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

أعد تعليق الخلايا في 2 mL من محلول PBS المنظم. اخلط الأجسام المضادة المقرر استخدامها لصبغ العوامل في أنبوب واحد: anti CD 14 و CD 32 و CD 16، واختياريًا anti CD 4. خذ مقداراً محدداً من هذا الخليط لصبغ أنبوب FLUOROCHROME minus one.

قم بتجهيز أنبوب FMO عن طريق نقل 5 µL من معلق الخلايا (لكل ملليلتر من الأنبوب) إلى أنبوب fax، ثم صبغ الخلايا باستخدام 2 µL من مزيج الأجسام المضادة الذي تم تحضيره مسبقاً. بعد ذلك، أضف خلايا غير مصبوغة وخرزات مغلفة بـ mouse IgG ليتم صبغها بفلوروكروم واحد في أنابيب fax فردية جديدة لاستخدامها كضوابط تعويض (compensation controls) لفرز الخلايا. ثم أضف 50 µL من anti-human CD 25 PE إلى المزيج، وأضف المزيج إلى بقية معلق الخلايا.

حضّن الأنابيب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. بعد تحضين الخلايا مع مزيج الأجسام المضادة، أضف محلول PBS المنظم إلى الخلايا ثم قم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي. علّق الراسب في محلول PBS المنظم بتركيز 10⁷ خلية/ملل.

استخدم أنبوبة FMO لتحديد حد العتبة لفرز الخلايا التائية الموجبة لـ CD 25. باستخدام استراتيجية البوابات هذه، قم أولاً بتحديد بوابة حول الخلايا السالبة لـ fite لاستبعاد الخلايا الموجبة لـ fitz، والتي تشمل الخلايا الوحيدة، والبلاعم، وجميع الخلايا غير التائية الموجبة لـ CD four الأخرى كما هو موضح في هذا الشكل. وفي مخطط منفصل، ارسم بوابات للخلايا التائية السالبة لـ CD 25 والخلايا التائية ذات التعبير المنخفض لـ CD 25، وخلايا treg ذات التعبير العالي لـ CD 25 كما في هذا الشكل.

بعد عملية التدفق وفرز المجموعات الفرعية للخلايا، يتم تجميع الخلايا في أنابيب التجميع عن طريق الطرد المركزي، ثم تُحفظ الخلايا التائية (T-cell) على الثلج حتى مرحلة الزرع. يتم ترقيم طبق 96 بئراً بقاع على شكل حرف U كما هو موضح في الجدول. يتم تعليق مقدار 50 µL من حبيبات المغلفة بـ CD3، المحسوبة بتركيز ثلاث حبيبات لكل خلية مستجيبة في البئر الواحد، في وسط غذائي كامل يحتوي على 10% مصل AB بشري مجمع في طبق الـ 96 بئراً، ثم تُخفف الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) التي تم تشعيعها مسبقاً في الوسط الغذائي لتصل إلى تركيز 5 × 10⁵ خلية/مل.

أضف 50 µL من الخلايا إلى طبق 96 بئراً، ثم أضف 2.5 × 10⁴ من خلايا T التي تكون CD4 موجبة وCD25 سالبة أو CD4 موجبة وCD25 منخفضة لكل بئر في ثلاث مكررات. أضف Tregs إلى الصف B وإلى الآبار المحددة كـ Tregs فقط في المزارع المشتركة بنسبة 1 إلى 10 كما هو موضح هنا. ثم قم بتحضين الطبق عند 37 °C في حاضنة تحتوي على 5% CO2 ورطوبة مشبعة لمدة 72 ساعة. بعد ذلك، قم بتحفيز الخلايا بـ 1 µCi من الثيميدين المسمى بالتريتيوم، ثم استمر في التحضين عند 37 °C لمدة 16 ساعة تالية بعد دمج الثيميدين في الساعات القليلة الأخيرة من المزرعة المشتركة.

استخدم جهاز حصاد Filter Mate لحصاد الخلايا في لوحة حصاد متعددة الشاشات. ثم قم بتغطية لوحة الحصاد بغطاء بلاستيكي شفاف مملوء مسبقاً بسائل وميضي. وأخيراً، قم بقراءة CPM لكل بئر.

باستخدام عداد وميضي، يمكن فصل مجموعات فرعية من الخلايا التائية بنقاء عالٍ بواسطة هذا النظام، كما يتضح في سلسلة مخططات النقط التالية؛ حيث تظهر الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 والسالبة لـ CD25 هنا في البوابة السفلية. وفي الشكل التالي، يمكن رؤية خلايا تائية عالية النقاء موجبة لـ CD4 ومنخفضة لـ CD25. تظهر هنا مجموعة نقية من خلايا CD4 الموجبة التي تم فرزها بالتدفق الخلوي.

تظهر الخلايا التائية التنظيمية (treg) ذات التعبير العالي عن CD 25 في بوابة التحكم العلوية. أظهرت مستنبتات الخلايا المفردة من الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) والخلايا التائية التنظيمية (tregs) المستمدة من أفراد أصحاء تكاثراً قليلاً أو معدوماً فوق المستوى الخلفي، وفقاً لما تم قياسه عن طريق دمج الثيميدين، بينما أظهرت الخلايا التائية الساذجة السلبية لـ CD 25 والخلايا التائية المنشطة داخل الجسم الحية ذات التعبير المنخفض عن CD 25 تكاثراً ملحوظاً يتم تثبيطه عند استزراع هذه الأنواع من الخلايا المستجيبة مع الخلايا التائية التنظيمية (treg). وعلى الرغم من ذلك، لوحظت اختلافات طفيفة في قدرة الخلايا التائية التنظيمية (tregs) على تثبيط الخلايا التائية الساذجة المستجيبة السلبية لـ CD 25 والخلايا التائية المنشطة داخل الجسم الحية ذات التعبير المنخفض عن CD 25.

لم تكن هذه المجموعة ضابطة ذات دلالة إحصائية. فقد أظهرت المزارع أحادية الخلية للخلايا المقدمة للمستضد (APCs) والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) من الأشخاص المعرضين للخطر تكاثراً ضئيلاً أو معدوماً فوق المستوى الأساسي، وفقاً لما تم قياسه عن طريق دمج الثيميدين. بينما أظهرت الخلايا التائية الساذجة السالبة لـ CD 25 والخلايا التائية المنشطة حيوياً ذات المستوى المنخفض من CD 25 مستويات تكاثر أقل مقارنة بالمجموعات الضابطة السليمة.

تعرضت الخلايا التائية المستجيبة لمزيد من التثبيط بواسطة الخلايا التائية التنظيمية (tregs) والمزارع المشتركة، حيث قدم المقايسة نتائج موثوقة. ويمكننا استنتاج أن قيم CPM المنخفضة تشير إلى عيوب محتملة في نقل الإشارة، وهو أمر يجب استقصاؤه بشكل أكبر في نوع مختلف من الدراسات. ومع ذلك، كان الفرق في قدرة tregs على تثبيط الخلايا التائية المستجيبة سالبة CD 25 مقابل الخلايا التائية المستجيبة منخفضة CD 25 لدى الأشخاص المعرضين للخطر فارقاً جوهرياً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الربط السلس بين جميع الخطوات الضرورية لإجراء اختبار وظيفي ناجح وموثوق للكشف عن وجود Tregs في الأشخاص الأصحاء والأشخاص الذين يعانون من ضعف في الجهاز المناعي؛ على سبيل المثال، الأشخاص المصابين بداء السكري من النوع الأول.