البيوفيزيائية فحوصات للتحقيق في الخواص الميكانيكية للنواة الخلية الطور البيني : الركيزة التطبيق الانفعال والتلاعب Microneedle

الهدف العام من التجارب التالية هو قياس الخواص الميكانيكية للواجهة البينية لنواة الخلية واتصالها الفيزيائي بالهيكل الخلوي المحيط بها. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تطبيق إجهاد ميكانيكي على خلايا مستزرعة على غشاء سيليكون شفاف وتصوير التشوهات النووية الناتجة. حيث تشير زيادة التشوهات النووية إلى انخفاض صلابة النواة، نظراً لأن التغيرات في الاقتران بين النواة والهيكل الخلوي يمكن أن تؤثر أيضاً على التشوهات النووية المستحثة.

يتم سبر انتقال القوة داخل الخلايا بين الهيكل الخلوي والنواة مباشرةً عن طريق تطبيق إجهاد موضعي على الهيكل الخلوي. ثم يتم تصوير إزاحة تراكيب NU النووية والهيكلية المحددة بصبغات فلورية. وتُستخلص النتائج التي توضح صلابة نوى الخلايا مقارنةً بالهيكل الخلوي المحيط بها.

بناءً على تجارب إجهاد الركيزة، يكشف مقايسة التحكم بالإبر الدقيقة أن تعطيل الاقتران بين النواة والهيكل الخلوي يتسبب في عيوب في نقل القوة داخل الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنيات مقارنة بالطرق الحالية، مثل شفط الماصات الدقيقة للنوى المعزولة، في أنها تتيح قياسات لميكانيكا النواة في خلايا حية سليمة دون الإخلال بالبنية الخلوية الطبيعية. ويمكن لهذه الطرق أن توفر رؤية حول كيفية تأثير التغيرات في تكوين الغلاف النووي على الخصائص الميكانيكية للنواة.

ويمكن تطبيق هذه الطرق أيضاً لدراسة دور الميكانيكا النووية في سياق أمراض مثل الاعتلالات العصبية المرتبطة بـ LA أو السرطان. يتكون كل طبق شد من طبق بلاستيكي مخصص بدون قاع بقطر ثلاث بوصات وحلقة دائرية بلاستيكية (O-ring) لتثبيت غشاء سيليكون، والذي يعمل كركيزة لزراعة الخلايا. ولتحضير طبق الشد، يتم تثبيت قطعة من غشاء السيليكون بمقاس أربع بوصات في أربع بوصات بين الحلقة الدائرية والطبق، ثم تُقص الزيادات من الغشاء بعناية، ويُشطف طبق الشد بالماء منزوع الأيونات، ثم يُوضع الطبق في جهاز التعقيم (autoclave) قبل طلاء غشاء السيليكون بجزيئات المصفوفة خارج الخلوية، مع وضع نقطة مرجعية على الجزء الخارجي من الغشاء في المركز السفلي.

ستساعد هذه العلامة المرجعية في التعرف على الخلايا ذاتها أثناء تجارب الإجهاد لتطبيق الإجهاد أحادي المحور. يتم وضع شريطان متوازيان من الشريط اللاصق حول النقطة المرجعية لتقييد تشكل الغشاء في بُعد واحد. ولضمان الالتصاق الأمثل للخلايا، قم بطلاء أغشية السيليكون بـ 3 µg/mL من الفيبرونيكتين أو أي بروتينات مناسبة للمادة الخلالية خارج الخلوية.

قم بتغطية طبق التصفية بطبق بوليستيرين مقلوب بقطر 10 سنتيمتر، وحضنه طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في اليوم التالي. اشطف الغشاء مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة البروتين الزائد. املأ الطبق بـ 10 ملليلتر من وسط النمو وضعه جانباً.

بمجرد تحضير طبق غشاء السيليكون المطلي، يتم فصل الخلايا باستخدام trypsin بتركيز 0.05%، ثم تُزرع الخلايا الملتصقة في الطبق باستخدام وسط نمو. يتم توضيح هذا الإجراء باستخدام خلايا جنينية للفأر.

يتم تحضين الخلايا الليفية (Fibroblasts) أو الخلايا المتوسطة (mes) لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة تحت ظروف استزراع طبيعية. يشتمل المجهر المقلوب المجهز لتجارب إجهاد الركيزة على جهاز إجهاد يتكون من لوحة قاعدة يتم تركيبها على منصة المجهر. وتحمل هذه اللوحة قرصاً بلاتينياً أسطوانياً مركزياً، يعمل على تطبيق الإجهاد على القسم المركزي من غشاء السيليكون.

يحتوي الجهاز أيضاً على صفيحة متحركة تثبت طبق الإجهاد ويمكنها الانزلاق للأعلى وللأسفل على أربعة دبابيس توجيه، بالإضافة إلى ثقل يزن خمسة أرطال لتطبيق الحمل. ومن أجل تصوير النوى، يتم تحضين الخلايا في طبق الإجهاد مع 1 µg/mL من صبغة הוocked لمدة 15 دقيقة عند 37 °C. وبعد التحضين، يتم سحب الوسط واستبداله بـ 15 mL من وسط نمو خالٍ من الفينول الأحمر يحتوي على 25 mM من heis.

بعد ذلك، قم بربط الطبق في حامل الأطباق ووضع الشحم بعناية على محيط الجزء السفلي من الغشاء السيليكوني لضمان انزلاق الغشاء على طول البلاتين المركزي. تأكد من بقاء القسم المركزي من الغشاء نظيفاً. ضع اللوحة القاعدة على لوحة منصة المجهر وقم بتثبيت حامل الأطباق بعناية على اللوحة القاعدة.

تأكد من أن الغشاء السيليكوني لطبق الإجهاد يستقر بشكل فضفاض على الصفيحة المركزية في وضع الراحة الأولي. بعد ذلك، قم بتركيز الرؤية على الجزء السفلي من الغشاء السيليكوني وحدد نقطة المرجع السوداء المركزية. ستعمل هذه النقطة كنقطة بداية لجميع عمليات الحصول على الصور وتساعد في تحديد الخلايا نفسها أثناء وبعد عملية التمديد.

في هذه الصورة، تملأ النقطة المركزية كامل مجال الرؤية. بدءاً من حدود النقطة، قم بضبط التركيز لرؤية الخلايا والجزء العلوي من غشاء السيليكون. ابحث عن خلايا منتشرة جيداً ذات نوى تقع في المركز.

قم بالتقاط صورة تباين الوجه (face contrast image)، والتي يجب أن تركز على حدود الخلية والغشاء السيليكوني. بعد ذلك، التقط صورة فلورية لصبغة الخطاف النووي (nuclear hook stain)، والتي يجب أن تركز على المستوى المركزي للنواة. بعد التقاط صور لخمس إلى 15 خلية، عد مرة أخرى إلى النقطة المركزية.

ضع الوزن ببطء على طبق الإجهاد لضمان تطبيق إجهاد منتظم في مركز الطبق. يتم تحديد الحد الأقصى لإجهاد الركيزة المطبق بواسطة فواصل نايلون موضوعة على دبابيس المحاذاة الرأسية. بعد تطبيق الإجهاد، ركز على الجزء السفلي من غشاء السيليكون وحدد موقع نقطة المرجعية مرة أخرى، وابدأ من هذه النقطة.

أعد تحديد موقع الخلايا نفسها مرة أخرى، والتقط صورة تباين طوري، وصورة فلورية للنواة في كل خلية تحت إجهاد كامل، مع محاولة مطابقة المستويات البؤرية للصور الأولية بدقة. يجب ألا تتجاوز هذه العملية 10 دقائق لتجنب إعادة التشكيل النشط وتكيف الخلية مع الركيزة الغريبة. بعد الحصول على جميع الصور المقابلة، أعد منصة المجهر إلى نقطة البداية.

أزل الوزن بعناية من لوحة حامل الطبق واترك الغشاء السيليكوني ليرتخي إذا لزم الأمر. ادفع طبق التصفية بلطف إلى الأعلى حتى يعود إلى موضعه الأصلي. ثم قم بالتقاط صور تباين الطور والفلورية.

يتم تحليل صور الخلايا بعد تطبيق الإجهاد، تماماً كما هو موصوف في صور الإجهاد، بالإضافة إلى صور الخلايا والنوى المحددة بفلوروفورات قبل وأثناء وبعد تطبيق الإجهاد، وذلك لحساب الإجهاد النووي المعياري. في هذا العرض التوضيحي، يُستخدم نص برمجّي مكتوب بلغة MATLAB مخصص للتحليل، ولكن تتوفر عدة خيارات بديلة لحساب إجهاد الركيزة المطبق يدوياً من خلال مطابقة مواقع ثلاث إلى ست نقاط تحكم تقع على الغشاء بين الصور المقابلة قبل الإجهاد وبعده. بعد ذلك، يقوم برنامج MATLAB بحساب إجهاد الغشاء المطبق عن طريق مقارنة مواقع نقاط التحكم المتطابقة بين صور ما قبل الإجهاد وصور الإجهاد الكامل.

تتم أيضاً مقارنة المواضع بالنسبة للانفعال المتبقي بين صور ما قبل التدريب وصور ما بعد الانفعال. تُستخدم نقاط التحكم في الوقت ذاته لمطابقة أزواج الصور، مما يساعد في اكتشاف الخلايا المتضررة أو المنفصلة. بعد ذلك، يتم تحديد النوى يدوياً باستخدام برنامج MATLAB منفصل يقوم بحساب الانفعال النووي لكل نواة على حدة.

يتم تحقيق ذلك عن طريق مطابقة حجم النواة بين الصور الفلورية المقابلة قبل الإجهاد الكامل وبعده، أو عن طريق مطابقة العلامات داخل النواة لمراعاة الاختلافات الطفيفة في إجهاد الغشاء المطبق بين التجارب المختلفة. ويُعبر عن النتائج على شكل إجهاد نووي معياري، والذي يُعرَّف بأنه نسبة الإجهاد النووي المستحث إلى إجهاد الغشاء المطبق المحسوب لكل نواة.

تتوفر سكربتات MATLAB من مختبر lambing عند الطلب. وكخطوة نهائية، يتم التحقق من صحة كل نواة واستبعاد القياسات المأخوذة من الخلايا التي تنفصل أو تتضرر أثناء تطبيق الإجهاد. تم تصوير خلايا MEFs المنتشرة عبر منطقتين متمايزتين على غشاء السيليكون باستخدام مجهر تباين الطور والمجهر الفلوري قبل وأثناء وبعد تطبيق إجهاد محوري بنسبة 20%UNI؛ وما يظهر هنا هو مثال لتجربة ناجحة تحتوي على نوى صالحة من خلايا نجت من تطبيق الإجهاد دون حدوث أي ضرر أو انفصال.

في المقابل، انكمشت الخلايا الموضحة هنا أو انفصلت جزئياً أثناء تطبيق الإجهاد، وبالتالي تم استبعادها من التحليل. تُظهر الخلية الموجودة على الجانب الأيسر علامات تلف في الهيكل الخلوي وانهيار النواة، بينما تنفصل الخلية الموجودة على الجانب الأيمن جزئياً وتنكمش أثناء تطبيق الإجهاد. ويمكن أن يكون ذلك مؤشراً على تعرض الخلايا لإجهاد مفرط.

يظهر هنا تحليل للإجهاد النووي المعير في مجموعة من خطوط خلايا مختلفة من فئران تعاني من نقص في Lamin AC، حيث تعبر هذه الخلايا بشكل خارجي إما عن ناقل فارغ أو عن Lamin A من النوع البري مقارنة بخلايا من أشقاء من النوع البري؛ حيث يؤدي فقدان التعبير عن بروتينات الغلاف النووي Lamin AC إلى زيادة في الإجهاد النووي المعير. يشير هذا إلى انخفاض صلابة النواة، وهو ما يمكن استعادته جزئياً أو كلياً عن طريق إعادة إدخال Lamin A من النوع البري. للتحضير لتجربة المناولة بالإبر الدقيقة، قم بتحضين طبق زراعة خلايا بقاعدة زجاجية بحجم 35 ملم مع تركيز منخفض من الفيبرونكتين لمدة ساعتين عند 37 °C، وبعد التحضين، اغسل الطبق مرتين باستخدام HBSS وأضف 2 mL من وسط النمو إلى الطبق.

بعد ذلك، يتم هضم الخلايا الليفية الجنينية للفئران باستخدام 0.05% trypsin وزرعها في وسط نمو على أطباق ذات قاع زجاجي مطلية بالفيبرونكتين في 2 mL من وسط النمو. وللحصول على خلايا غير متلاصقة وملتصقة بشكل فردي، توضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة طوال الليل؛ ولصبغ الخلايا، يُضاف صبغ الميتوكوندريا MIT tracker وصبغ النواة Hoechst إلى وسط النمو. يُضاف وسط النمو هذا إلى الخلايا ثم تتبعها عملية الحضن.

بعد ذلك، اغسل الخلايا عن طريق تحضينها في محلول ملحي منظم من هانك (hank's buffered salt saline) لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف وسط نمو خالٍ من الفينول الأحمر مع 25 millimolar من He piece إلى الخلايا من أجل التصوير.

بالنسبة لتجربة الإبر المجهرية، أدخل إبرة مجهرية تم سحبها مسبقًا في ملقط مجهري متصل بمجهر مقلوب مزود بكاميرا ذات جهاز اقتران شحني رقمي (CCD). قم بضبط تركيز الإبرة المجهرية بالقرب من خلية واحدة. التقط صورة واحدة للخلية الواحدة قبل إدخال الإبرة المجهرية في الهيكل الخلوي.

في تباين الطور، يتم التقاط صورة فلورية واحدة لصبغة hooks 3 3, 3 4 2 وصورة فلورية واحدة لصبغة الميتوكوندريا باستخدام عدسة شيئية 60x على مجهر مقلوب. وباستخدام الميكرو-مناور (micro manipulator)، يتم إدخال الإبرة المجهرية بعناية في سيتوبلازم الخلية على مسافة ثابتة بعيداً عن المحيط النووي، ثم يتم التقاط صورة واحدة بتباين الطور، وصورة فلورية واحدة لصبغة hooks 3 3, 3 4, 2، وصورة فلورية واحدة لصبغة الميتوكوندريا. يتم تحريك الإبرة المجهرية مسافة محددة باتجاه محيط الخلية بسرعة 1 ميكرومتر في الثانية، باستخدام الميكرو-مناور المتحكم به حاسوبياً مع التقاط الصور تلقائياً كل 10 ثوانٍ.

بينما تتحرك الإبرة الدقيقة لمسافة محددة باتجاه محيط الخلية، يجب التحكم في المُنقِّل الدقيق (micro manipulator) عبر جهاز كمبيوتر لتحقيق تلاعب دقيق متسق. يتم في النهاية الحصول على الصور بعد إزالة الإبرة الدقيقة من الهيكل الخلوي؛ حيث يتم تحليل صور الميزات الموسومة فلوريسنتياً للنواة والهيكل الخلوي التي تم الحصول عليها قبل وأثناء وبعد التلاعب بالإبرة الدقيقة لحساب إزاحة المناطق الصغيرة داخل الخلايا. في هذا العرض التوضيحي، يتم استخدام نص برمجي (script) مكتوب خصيصاً بلغة MATLAB للتحليل، ولكن تتوفر عدة خيارات أخرى.

يتوفر نص MATLAB البرمجي من مختبر lambing عند الطلب لقياس الإزاحة الناتجة عن الإبرة المجهرية. يستخدم برنامج MATLAB خوارزمية الارتباط المتقاطع الموحد لحساب الإزاحة بين الموقع الأصلي للمعالم المنسومة فلورسنتياً وموضعها المحدد حديثاً. ثم تُعرض الإزاحات كخرائط متجهة وتُخزن كقيم عددية.

تتمثل الخطوة التالية في استخدام خرائط متجهات الإزاحة الناتجة لتحديد متوسط الإزاحات داخل الهيكل الخلوي أو النواة باستخدام برنامج matlab. أولاً، اختر ثلاث نقاط أو أكثر داخل الهيكل الخلوي عند موقع تطبيق الإجهاد. في خريطة متجهات الإزاحة، خذ متوسط القيمة العددية لتحديد مقدار إجهاد الهيكل الخلوي بالقرب من موقع التطبيق والذي تولد أثناء استخدام الإبرة المجهرية.

بعد ذلك، حدد ثلاث نقاط أو أكثر داخل النواة بالقرب من موقع تطبيق الإجهاد واحسب القيمة المتوسطة. تمثل هذه القيمة مقدار الإجهاد النووي بالقرب من موقع تطبيق الإبرة المجهرية. وباستخدام الطريقة نفسها، حدد الإجهاد النووي وإجهاد الهيكل الخلوي بعيداً عن موقع تطبيق الإجهاد من خلال نقاط مختارة في هذه المناطق المحددة.

أُجري اختبار مناولة بالإبر المجهرية لقياس انتقال القوة داخل الخلايا. تظهر هنا صور مجهر تباين الأطوار وصور فلورية لخلية ليفية مُوسومة بصبغة نووية زرقاء وصبغة MIT tracker green للميتوكوندريا. أُدخلت إبرة مجهرية في الهيكل الخلوي على مسافة محددة من النواة، ثم حُرِّكت لاحقاً باتجاه محيط الخلية.

تم تتبع إزاحة الميتوكوندريا قبل وأثناء وبعد إجهاد الهيكل الخلوي، ثم رُسمت هذه الإزاحات على شكل متجهات. يمثل كل متجه الإزاحة المحسوبة كفرق بين الموقع الأصلي والموضع المحدد حديثاً. وقد استُبعدت من التحليل المناطق ذات الكثافة التصويرية المنخفضة أو الأنسجة غير الكافية.

تم بعد ذلك قياس الإزاحة الهيكلية الخلوية والنووية في مناطق مختارة عند مسافات متزايدة من موقع تطبيق الإجهاد لكل من الخلايا الليفية الضابطة والخلايا الليفية. ففي الخلايا التي تمتلك اقتراناً نووياً هيكلياً سليماً، تنتقل القوى عبر الخلية بأكملها، مما يؤدي إلى تشوه نووي وهيكلي مستحث يتلاشى ببطء بعيداً عن موقع تطبيق الإجهاد. وفي المقابل، تظهر الخلايا ذات الاقتران النووي الهيكلي المختل إزاحة موضعية بالقرب من موقع التطبيق وتشوهًا مستحثًا طفيفًا فقط في المناطق الأبعد.

يُلاحظ تطبيق إجهاد هيكلي خلوي مماثل في موقع إدخال الإبرة الدقيقة لكل من الخلايا الليفية الضابطة والخلايا الليفية ذات الاقتران النووي الهيكلي الخلوي المختل. ومع ذلك، كان الإزاحة النووية والهيكلية الخلوية المستحثة في المناطق الأخرى أصغر بشكل ملحوظ في الخلايا الليفية ذات الاقتران النووي الهيكلي الخلوي المختل مقارنة بالخلايا الضابطة. وبالتالي، فإن انخفاض الإزاحة الهيكلية الخلوية والنووية بعيداً عن موقع تطبيق الإجهاد يشير إلى أن الانتقال القسري بين الهيكل الخلوي والنواة قد تعطل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية قياس الميكانيكا النووية ونقل القوة داخل الخلايا بين النواة والهيكل الخلوي. يمكنك استخدام هذه التقنيات لدراسة تأثير الطفرات في بروتينات الغلاف النووي أو التغيرات في تكوين الغلاف النووي التي تحدث أثناء النمو أو في السرطان.