اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات مجمع المتفطرة السل للأدوية الخط الأول والثاني عن طريق التخفيف في شكل حساء بلايت Microtiter

تتوفر أدوية قليلة نسبياً لعلاج mycobacterium tuberculosis، لذا فإن مقاومة أي دواء تشكل مصدر قلق. يصف هذا المقال المرئي إجراءً لاختبار مقاومة M tuberculosis للمضادات الحيوية لـ 12 دواءً ميكروبياً مختلفاً في آن واحد. وبناءً على ذلك، فإن القدرة على الكشف السريع عن المقاومة للمضادات الميكروبية في M tuberculosis تكتسب أهمية كبيرة في الجهود الرامية إلى السيطرة على زيادة السلالات المقاومة؛ وهنا نقوم باختبار الحساسية للمضادات الحيوية.

يتم استزراع M tuberculosis أولاً على أوساط صلبة أو في أوساط مرقية، للحصول على معلق بكتيري. يتم تحضير اللقاح وإضافته إلى طبق معايرة دقيق (microtiter plate) يحتوي على تركيزات مختلفة من 12 عقاراً، بما في ذلك عقاقير الخط الأول والخط الثاني. وبعد فترة الحضانة، يتم تحديد مدى النمو في كل بئر إما يدوياً باستخدام صندوق مرآة أو باستخدام قارئ أطباق شبه آلي.

تشير البيانات الناتجة إلى التركيز المثبط الأدنى لكل عقار تم اختباره، وتوضح المضادات الحيوية التي تظهر السلالة المختبرة من مرض السل مقاومة تجاهها. وتساعد هذه النتائج في اختيار العقار المناسب لعلاج مرض السل. مرحباً، اسمي نانسي إيك وأنا مديرة مختبر بكتيريا الميكوبكتيريوم في مايو كلينك في روتشستر، مينيسوتا.

سوف نصف اليوم طريقة لإجراء اختبار الحساسية للمضادات الحيوية لبكتيريا mycobacterium tuberculosis. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التخفيف في المرق (macro broth dilution)، في أنه يتم تحديد التركيز المثبط الأدنى (MIC) لكل دواء، كما يتم اختبار 12 مضاداً حيوياً بشكل متزامن. وسيقوم كورت جود، وهو أخصائي جودة في مختبري، بتوضيح الإجراء أثناء العمل على طاولة المختبر.

استعد لهذا الإجراء عن طريق وضع ملصقات تعريفية تتضمن اسم المريض ورقم تعريف العينة على طبق آجار دم، وثلاثة أطباق Middlebrooks 7H10، وأنبوب خرز زجاجي يحتوي على محلول ملحي وتوين، ولوحة معايرة دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، ضع ملصق "نقاء" (purity) على طبق آجار الدم وأطباق 7H10. حدد أحد أطباق 7H10 هذه بملصق "تعداد مستعمرة 1:1" والطبق الآخر بملصق "تعداد مستعمرة 1:50".

ثم ضع الصينية في وحدة النقل. بعد ذلك، استعد للعمل في مرفق مستوى السلامة البيولوجية الثالث BSL three من خلال ارتداء مئزر مغلق من الأمام، وغطاء للرأس، وقفازات، وأغطية للأحذية، وجهاز تنفس. وهنا، يتم استخدام جهاز تنفس pappa.

ثم استخرج الصينية من نافذة النقل. بعد ذلك، وفي منشأة المستوى الثالث من السلامة البيولوجية (BSL three)، قم بتطهير سطح كابينة السلامة البيولوجية. ثم ضع منشفة ورقية مشبعة بالمطهر داخل الغطاء، على بُعد ست بوصات تقريبًا من لوحة فتحة التهوية المجاورة للمنشفة الورقية.

ضع حلقات التلقيح، وأدوات الماصات ورؤوسها، وحاوية مناسبة للتخلص من النفايات، وجهاز nephi، وجهاز TER، وجهاز vortex. بمجرد تجهيز خزانة التدفق الصفحي، ضع الكائن الحي على منشفة ورقية إلى جانب حامل يحتوي على معيار McFarland 0.5، ومرق seven H nine مع OADC، وأنبوب خرزات ملحية. يتم إعداد هذا التجهيز من وسط صلب.

قم بتحضير اللقاح من مزرعة في وسط صلب من عينة مريض. استخدم عروة معقمة لكشط المستعمرات ونقلها إلى أنبوب خرزات زجاجية يحتوي على محلول ملحي بتوين. قم برج المعلق باستخدام جهاز الفورتيكس لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية.

افحص العينة بصرياً، وقارنها بمعيار McFarland. يجب أن تكون الكمية المنقولة مساوية للمعيار أو أكبر منه. وإذا لم يكن الأمر كذلك، أضف المزيد من العينة البكتيرية وقم بالرج باستخدام جهاز vortex مجدداً.

بمجرد مطابقة معيار McFarland، اترك اللقاح ليستقر لمدة 15 دقيقة للسماح للتكتلات البكتيرية الأكبر بالترسيب. بعد ذلك، استخدم مقياس nefi TER لقياس كثافة البكتيريا المعلقة لضبطها عند الصفر. الـ nephi ter.

أولاً، ضع أنبوب خرز ملحي فارغاً في جهاز nephi ter. اضغط على زر المعايرة (calibrate) لتصفير الجهاز، ثم ضع معيار McFarland 0.5 في جهاز Nephi ter واضغط على زر المعايرة مرة أخرى. بمجرد معايرة الجهاز، قم بإزالة معيار McFarland وأدخل اللقاح.

يجب أن تكون قراءة اللقاح مساوية لقراءة معيار ماكفارلاند (McFarland). إذا كانت القراءة منخفضة للغاية، قم بإزالة الأنبوب ونقل المزيد من البكتيريا من الطبق، ثم استخدم جهاز المرجّ (vortex) واقرأ العينة مرة أخرى.

إذا كانت القراءة مرتفعة للغاية، أضف محلول saline tween إلى الأنبوب ثم استخدم جهاز الـ vortex. بعد ذلك، قم بقراءة العينة مرة أخرى. استمر في ضبط اللقاح حسب الحاجة حتى يتطابق تركيز البكتيريا مع معيار McFarland.

بعد ذلك، استخدم ماصة سعة 200 microliter ورأس ماصة طويل مقاوم للهباء الجوي لسحب 100 microliters من اللقاح من الثلث العلوي للأنبوب. ولتجنب أي تكتلات تترسب في قاع مرق Middlebrook seven H nine، قم برج المرق الملقح ببطء باستخدام جهاز الرج (vortex) لمدة 20 ثانية قبل توزيع اللقاح على الأطباق. ابدأ بإخراج لوحة المعايرة الدقيقة (microtiter plate) من عبوة الشركة المصنعة. إذا كان المجفف باللون الأزرق أو إذا كانت العبوة القصديرية تالفة، فلا تستخدمها.

تحتوي اللوحة بالفعل على 12 مضاداً للميكروبات سيتم اختبارها في كل بئر، بما في ذلك الأدوية الأكثر فعالية أو أدوية الخط الأول وأدوية الخط الثاني. صب ملقح مرق H nine السبعة بعناية في أنبوب اختبار مع الحرص على عدم توليد رذاذ. بعد ذلك، ضع لوحة المعايرة الدقيقة بحيث يكون الملصق موجهاً للخارج كما هو موضح هنا، واستخدم ماصة ذات 12 قناة لإضافة 100 µL من الملقح إلى كل بئر.

بعد ذلك، قم بتجهيز الأطباق لإجراء تعداد المستعمرات. أولاً، قم بتجهيز طبق غير مخفف عن طريق نقل حلقة سعة 1 µL من العينة من بئر الضابط الموجب إلى طبق 7H10 المسمى من 1 إلى 1. ثم استخدم الحلقة لتخطيط الطبق كما هو موضح هنا.

بعد ذلك، ولتحضير تخفيف بنسبة 1 إلى 50، انقل حلقة سعة 1 µL من بئر الضابط الموجب وقم بتحريكها في أنبوب يحتوي على 50 µL من الماء. ثم قم بتخطيط 1 µL من هذا التخفيف على الطبق المسمى 1 إلى 50. قم بتلقيح أطباق النقاء عن طريق نقل 50 µL من اللقاح من المرق باستخدام الماصة إلى أطباق أغار الدم وأطباق 7H10 المسمى مناسباً، ثم قم بالتخطيط من أجل العزل.

ثم قم بوضع أنبوب trth آخر فوق أنبوب trth الملقح وضعهما برفق في حاوية النفايات. ضع سدادة لاصقة على لوحة المعايرة الدقيقة (microtiter plate). بعد ذلك، وباستخدام الغطاء الخلفي الأبيض، اضغط بقوة على كل بئر لضمان الإغلاق التام، مع التأكد من عدم وجود أي ثنيات.

قم بتطهير لوحة المعايرة الدقيقة (microtiter plate) عن طريق مسحها بمنشفة ورقية مبللة بمطهر قاتل للمتفطرات السلية. بعد ذلك، ضع لوحة المعايرة الدقيقة في كيس بلاستيكي وأغلقه بإحكام باستخدام الختم الحراري. وأخيراً، قم بتطهير جميع المواد، بما في ذلك جهاز الطرد المركزي الدوار (vortex)، والألواح، والأنابيب، عن طريق مسحها بمطهر قاتل للمتفطرات السلية.

هنا يتم استخدام الرذاذ المعقم (pro spray) بعد مرور وقت كافٍ لضمان التطهير، وهو 15 دقيقة للرذاذ المعقم. تُغلق الأطباق بشريط لاصق (scotch tape) وتوضع في أكياس بلاستيكية، ثم تُخرج المستلزمات المختومة من كابينة السلامة البيولوجية وتوضع في فتحة النقل (pass through).

يتم إغلاق كيس النفايات الأحمر وإحكام إغلاقه برابط التواء في هذه المرحلة، ثم يتم خلع الرداء الواقي وأغطية الأحذية والقفازات. وبعد الانتقال إلى الغرفة التمهيدية وغسل اليدين، يتم نزع جهاز التنفس وتطهيره وتخزينه، وبعد غسل اليدين مرة أخرى، يتم ارتداء رداء واقٍ نظيف ومغادرة جناح مستوى السلامة البيولوجية الثالث BSL three. بعد ذلك، يتم تعقيم حاوية النفايات بجهاز الأوتوكلاف.

بعد ذلك، قم بتحضين لوحة المعايرة الدقيقة (microtiter plate) والألواح السبعة من H 10 وblood auger بحيث تكون فتحاتها للأعلى في حاضنة بدرجة حرارة 35 إلى 37 °C مع 5 إلى 10% CO2 في مختبر من المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (BSL two). ويعد هذا الإجراء مقبولاً لأن اللوحة محكمة الإغلاق وموضوعة داخل كيس بلاستيكي. يبلغ زمن جيل mycobacterium tuberculosis حوالي 12 إلى 24 ساعة، لذا سيمر أسبوع على الأقل قبل إمكانية رؤية النمو على شكل تكوين كتلة خلوية (cell pellet) في قاع بئر التحكم. وفي اليوم العاشر، قم بإجراء قراءة يدوية باستخدام جهاز MIRU عن طريق وضع لوحة AST microtitter المختومة على منصة صندوق MIRU.

استخدم مصباح مكتب للمساعدة في معاينة النمو، وقم بتعديله حسب الحاجة للحصول على أفضل تباين. تحقق من آبار التحكم في النمو، وهي في هذه الحالة H 11 و H 12، من خلال النظر إلى المرآة. في حال وجود نمو، سيبدو البئر عكراً أو يبدو وكأنه يحتوي على رواسب كما هو موضح هنا.

إذا لم يحدث نمو كما هو موضح في هذا المثال، فسيظهر البئر صافياً. في هذه الحالة، أعد الطبق إلى الحاضنة واستمر في التحضين لمدة تصل إلى 21 يوماً. وبالنسبة لكل حالة، قارن النمو بمجموعة الضبط.

بعد ذلك، بالنسبة لكل سجل دواء، يتم تحديد أول تخفيف لا يحدث فيه نمو. وهذا هو التركيز المثبط الأدنى أو MIC للدواء. لفحص النتائج باستخدام قارئ أطباق آلي مثل جهاز vision، ابدأ بفتح برنامج Myco TB a ST plate وتسجيل الدخول، ثم ضع الطبق المختوم بحيث يكون الرمز الشريطي مواجهاً للخارج. كما هو موضح هنا، يظهر النمو على شاشة الكمبيوتر كعكارة أو كترسب للخلايا في قاع البئر.

أولاً، افحص ضوابط النمو. كما سبق. إذا كانت النتيجة سلبية بالنسبة للنمو، فضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة تصل إلى 21 يوماً.

إذا كانت النتيجة إيجابية، يتم تسجيل النتائج عن طريق لمس أول بئر على الشاشة لا يظهر نمواً لكل عقار. في بعض الحالات، تترسب البكتيريا أو الرواسب أو العقاقير في قاع البئر. وتُعرف هذه الظاهرة باسم التتبع (trailing)، ويُستدل عليها بوجود عدة آبار تحتوي على كريات بنفس الحجم، ولا تُعتبر في الواقع نمواً إيجابياً.

بعد ذلك، يتم فحص أطباق H 10 وأطباق أغار الدم السبعة لتحديد التركيزات البكتيرية وتقييم النقاوة. يجب ألا يظهر أي نمو في طبق أغار الدم بعد 48 ساعة. ويشير النمو في طبق أغار الدم إلى حدوث تلوث ببكتيريا سريعة النمو.

في حالة حدوث نمو، يجب تكرار اختبار المعايرة الدقيقة (microtiter test). يجب أن تظهر لوحة نقاء H 10 نمواً لكائن حي واحد فقط. يجب أن تظهر سلالة EM tuberculosis بلون بيج، وتكون مجعدة وخشنة. وفي حال حدوث تلوث، يلزم تكرار اختبار المعايرة الدقيقة باستخدام مزرعة نقية.

لتقييم التركيز البكتيري، قم بعد المستعمرات على طبق H 10 السابع. ثم باستخدام الجدول الموجود في المستند المكتوب المرفق، احسب أعداد المستعمرات. تم استنبات Mycobacterium tuberculosis من عينة مريض، وتم تقييم مقاومة المضادات الحيوية كما هو موضح في هذا الفيديو؛ حيث توجد في الطبق المعروض هنا 12 نوعاً مختلفاً من العقاقير بتركيزات متزايدة، بحيث تكون التركيزات الأعلى في الأعلى والتركيزات الأدنى في الأسفل.

يتم تحديد التركيز المثبط الأدنى، أو الـ MIC للعقار، من خلال أدنى تركيز للعقار لا يظهر أي نمو بكتيري، وهو محاط بدائرة في الصورة الموضحة هنا باستخدام نقاط الفصل المعيارية التي وضعها معهد المعايير السريرية والمخبرية. وتشير البيانات المعروضة هنا إلى أن سلالة الـ TB هذه ستكون مقاومة لعقاري Isid و Rifampin. أما مخبرياً، فإن قيم الـ MIC المرتفعة الملاحظة في عدة عقارات أخرى، بما في ذلك oin و moxifloxacin و streptomycin و rifabutin، تشير إلى مقاومة سلالة EM tuberculosis لهذه العوامل.

يجب أن يستخدم أخصائي الأمراض المعدية الخبير في علاج السل نتائج التركيز المثبط الأدنى (MIC) لوضع خطة علاجية فردية. بمجرد إتقان هذه التقنية، يستغرق إعداد عزلة واحدة حوالي 40 دقيقة. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هذا ممرض تنفسي، لذا يجب تجنب توليد الرذالات الجوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد اختبار الحساسية للمضادات الميكروبية لبكتيريا mycobacterium tuberculosis باستخدام طريقة التخفيف الدقيق في المرق. لا تنسَ أن العمل مع mycobacterium tuberculosis يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل الحماية التنفسية حيثما كان ذلك مطلوباً.