لماذا يتيح وسم سكر الآزيدو (azidosugar labeling) الإثراء الانتقائي لبروتينات سطح الخلية؟

تُدمج سكريات الأزيدو (Azidosugars) استقلابيًا في السيالوجليكانات (sialoglycans) على الخلايا الحية، مما يسمح بالاقتران بالبيوتين أو الفلوروفور عبر كيمياء النقر (click chemistry) للعزل والكشف الانتقائي للبروتينات السكرية المحددة.

كيف يؤثر الاستزراع المشترك مع الخلايا البطانية على تعبير البروتينات السطحية للخلايا الجذعية العصبية؟

تعزز السيتوكينات والكيموكينات التي تفرزها الخلايا البطانية تمدد الخلايا الجذعية العصبية وتغير ملامح البروتينات السكرية السطحية، والتي يمكن الكشف عنها بعد وسم السكر الأزيدي.

ما هي القياسات الكمية التي تتيحها عملية الوسم والإثراء؟

تسمح هذه الطريقة بالتقدير الكمي لوفرة البروتينات السكرية في الخلايا الجذعية العصبية باستخدام مطيافية الكتلة، وذلك في ظروف الزراعة الفردية مقابل ظروف الزراعة المشتركة.

لماذا تعد متطلبات التكرار مهمة للتحقق من صحة الهدف في نموذج الزراعة المشتركة هذا؟

يضمن التوسيم والإثراء المتسقان عبر المكررات أن التغيرات الملحوظة في بروتينات السطح مرتبطة بشكل موثوق بالزراعة المشتركة للخلايا البطانية بدلاً من التباين في الزراعة.

ما هي القدرات التحليلية المطلوبة لتفسير بيانات وسم البروتينات السكرية؟

يتطلب الباحثون أنظمة قياس الطيف الكتلي أو أنظمة كشف الفلورة القادرة على تحديد وقياس كمية الببتيدات الموصومة بسكر الأزيد من عينات البروتين السطحي المخصبة.

وضع العلامات على علامات سطح الخلية العصبية باستخدام Azidosugar أثناء الزراعة المشتركة مع الخلايا البطانية

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 مشاهدات • 3:20 د • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ابدأ بإضافة تعليق الخلية البطانية لدماغ الفأر إلى إدراج الغشاء المنفذ للوحة الصافية.

أضف وسط نمو إلى القاع جيدا واحتضنه.

تساعد عوامل النمو والعناصر الغذائية الموجودة في الوسط الخلايا على النمو كطبقة أحادية.

قم بإزالة الوسيط من أسفل البئر ومن الإدراج.

اغسل الأسطح الداخلية والخارجية للملحق لإزالة أي حطام.

أضف وسيطا ملتصقا إلى الإدخال ، وانقل الملحق إلى بئر مغلف بمصفوفة يحتوي على جذع عصبي قشري أولي وخلايا سلفية ، أو NSPCs ، واحتضانه.

أضف سكر الأزيدو ، وهو تناظري غير طبيعي لسلائف حمض السياليك ، إلى كل من الخلايا البطانية و NSPCs ، واحتضنها.

تعزز السيتوكينات والكيموكينات التي تفرزها الخلايا البطانية نمو NSPCs إلى نسخ كبيرة تشبه الصفائح.

تتكامل السكريات الزادية في الهياكل السيالوجليكان على سطح خلية NSPC ، مما يؤدي إلى تسمية البروتين السكري. يتيح ذلك تحديد بروتينات سطح الخلية على NSPCs الموسعة.

لتحضير الخلايا البطانية ، قم بتعليق حبيبات خلية BEND3 من طبق بتري يبلغ طوله 0.10 سم عند التقاء 90٪ مع 9 ملليلتر من وسط خلية BEND3. أضف 1 مليلتر من تعليق الخلية في ملحق دعم واحد قابل للنفاذ. أضف 2 مل أخرى من وسط BEND3 لكل بئر في الغرفة السفلية للمصفوفة. استمر في زراعة الخلايا ليوم واحد عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد يوم واحد من طلاء الخلايا في الإدخالات ، قم بشفط الوسط برفق ، أولا من الغرفة السفلية ثم من الإدخالات. اغسل وجه الحشوات ثلاث مرات باستخدام DMEM الدافئ مسبقا. اغسل السطح الخارجي للحشوات عن طريق الشطف باستخدام DMEM الدافئ مسبقا. بعد ذلك ، أضف 1 ملليلتر من AM الدافئ مسبقا في ملحق واحد. انقل الإدخالات إلى الآبار ذات الخلايا القشرية الأولية. احتضان الاستزراع المشترك عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 ساعة.

قم بإذابة التيار المتردد₄ManNAz في DMSO لتحقيق تركيز مخزون يبلغ 200 ملليمول. استرجع لوحة الزراعة البطانية العصبية المشتركة من الحاضنة. أضف 1 ميكرولتر من مخزون Ac₄ManNAz إلى كل حجرة سفلية و 0.5 ميكرولتر لكل إدخال في الثقافة المشتركة. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 أيام. أثناء زراعة الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من RM لكل إدخال و 200 ميكرولتر من RM لكل حجرة سفلية لإعادة تغذية الخلايا البطانية والعصبية كل يومين.