البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء بيئات خلوية دقيقة لدراسة الأسئلة البيولوجية المتعلقة بسلوكيات الخلايا الفردية والجماعية التي تحدث في أبعاد ميكرومترية ونانوية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تصميم قوالب ستعمل في النهاية على توجيه وضع الخلايا. بعد ذلك، تُترجم هذه التصاميم إلى أسطح منقوشة عبر الطباعة الحجرية الضوئية، مما يسمح بإنشاء قوالب حجب البلازما عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة.

أخيراً، يتم ترتيب قوالب الحجب هذه على شكل حامل ثلاثي في طبق بتري للسماح بتعريض الأسطح السفلية بشكل انتقائي للبلازما، مما سيترك نمطاً كيميائياً حساساً للخلايا في المناطق الواقعة تحت كل قالب. ويمكن الحصول على نتائج توضح كيف يعتمد سلوك الخلية على بيئتها الدقيقة وتفاعلها مع الخلايا المجاورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول تأثيرات البيئات الدقيقة على سلوك الخلايا، مثل كيف تؤثر التفاعلات بين مجموعات الخلايا على الظواهر ذات الرتب الأعلى؟

وكيف تؤثر الإشارات النانوية تحت الخلوية على وظائف مثل الهجرة الصحية والتمايز؟ أولاً، استخدم الغراء السريع (super glue) لتثبيت شريحة ذات نمط على مجموعة من الشرائح الفارغة. بعد ذلك، قم بصنع حاوية من ورق الألمنيوم تكون أكبر قليلاً من مجموعة الشرائح، وبحجم كافٍ لاستيعاب 30 grams من مادة البولي ديميثيل سيلوكسان أو PDMS.

ضع مجموعة الشرائح في الحاوية، ثم صب PDMS فوق مجموعة الشرائح لإنشاء قالب أولي. بعد ذلك، قم بإزالة الغازات من PDMS بوضع الحاوية داخل غرفة تفريغ. تخلص من أي فقاعات موجودة في PDMS عن طريق إزالة وإعادة وضع الإصبع بسرعة فوق أنبوب صمام السحب عدة مرات للسماح للهواء بالتدفق لفترة وجيزة إلى الغرفة.

يتم إغلاق الصمام لمدة خمس دقائق من إزالة الغازات دون انقطاع. بعد ذلك، يُترك الـ PDMS ليتصلب في غطاء التدفق النظيف في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من يوم إلى يومين. وبمجرد التصلب، يتم نزع الـ PDMS من القالب الرئيسي، مما يشكل قالباً.

بعد ذلك، صب طبقة رقيقة من ستة جرامات من إيبوكسي مكون من جزأين تم خلطه للتو لمدة دقيقة واحدة في القالب الرئيسي. قم بإزالة الفقاعات من الإيبوكسي فوراً باستخدام دورات متعددة لتكسير الفقاعات قبل أن يتصلب الإيبوكسي. بعد ترك الإيبوكسي الذي تمت إزالة فقاعاته دون تحريك لمدة ساعة، سيتم معالجته جزئياً.

أضف المزيد من الإيبوكسي إلى القالب دون إجراء عملية إزالة الغازات لإنتاج بنية أكثر سمكاً يسهل التعامل معها في الخطوات اللاحقة. ثم اترك الإيبوكسي ليجف لمدة تتراوح من يوم إلى يومين. وبمجرد جفاف قالب الإيبوكسي، قم بإزالته من قالب PDMS الرئيسي، ثم لف الشريط اللاصق حول قالب الإيبوكسي لتشكيل حاوية.

يمكن بعد ذلك إنشاء قالب عمل عن طريق صب PDMS فوق قالب الإيبوكسي، وإزالة الغازات من PDMS ومعالجة القالب الجديد لمدة تتراوح من يوم إلى يومين. بعد معالجة قالب العمل، قم بنزع القالب عن الإيبوكسي وتخزين كليهما داخل أطباق بتري في حاوية بلاستيكية محكمة الإغلاق داخل غطاء التدفق للحفاظ على النظافة. لتحضير قالب لتشكيل الأنماط السطحية، اقطع أقساماً صغيرة من قالب العمل باستخدام شفرة حلاقة وضع هذه الأقسام في طبق بتري.

يتم تحديد مواقع مقاطع القالب هذه على ظهر طبق Petri باستخدام قلم تحديد دائم عن طريق رسم مخطط حول مكان استقرار مقاطع القالب، ثم يتم تشكيل حامل ثلاثي من المقاطع والضغط عليه لضمان التلامس المطابق بين القالب المستخدم وسطح طبق Petri. انظر إلى قاع الطبق للتأكد من دقة الوضع، وهو ما يستدل عليه بوجود قنوات يمكن رؤيتها بالعين المجردة أو باستخدام عدسة مكبرة صغيرة. ضع المجموعة في غرفة البلازما.

ابدأ المعالجة بالبلازما بعد عملية المعالجة بالبلازما. قم بإزالة القالب وترتيب الأوزان، ثم ضع طبق بتري داخل خزانة السلامة البيولوجية تحت الضوء فوق البنفسجي (UV) لمدة 10 دقائق للتعقيم. احفظ الطبق هناك حتى يتم استزراعه بالخلايا.

قم بتخفيف الخلايا التجريبية المختارة في أوساط زرعها القياسية للوصول إلى درجة التلاقي المطلوبة. عند وضعها على سطح طبق بتري المخطط، صب ثلاثة ملليلتر من محلول الخلايا في طبق بتري. قم بتحضين طبق بتري المخطط عند 37 درجة Celsius، و5% carbon dioxide، و100% humidity لعدة ساعات إلى عدة أيام للسماح للخلايا بالتجمع على النمط الذي أنشأته خلية البلازما.

يتم التحقق من النمط باستخدام مجهر تباين الطور. عند استنبات خلايا الورم الأرومي العصبي، يضاف 10 micromolar من حمض الريتينويك يومياً حتى لوحظ تمايز الخلايا إلى حالة شبيهة بالعصبونات. يتم استبدال وسط استنبات الخلايا القياسي كل ثلاثة إلى أربعة أيام.

تتمثل النتيجة النموذجية لتطبيق تقنية الطباعة الحجرية بالبلازما في تكوين نمط من الخلايا يشبه هيكلاً عشوائياً أو طبيعياً. ويمكن رؤية مثال على ذلك هنا في هذا الشكل مع الخلايا العصبية التي تمايزت باستخدام حمض الريتينوئيك على نمط من الخطوط. وهنا في هذا الشكل حيث تم إنشاء خطوط وشبكات من الخلايا العصبية، يمكن أيضاً استخدام أنواع خلوية أخرى غير الخلايا العصبية كما هو موضح في هذين الشكلين التاليين؛ حيث يظهر هذا الشكل الخلايا البطانية لوريد الحبل السري البشري، ويظهر هذا الشكل خلايا العضلات الهيكلية C2C12 وهي تشكل شبكات كما هو موضح هنا.

يمكن أيضاً تشكيل مواد مثل البولي ليسين (polylysine) في أنماط معينة لتسهيل التصاق أنواع محددة من الخلايا ولأغراض أخرى. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن دمج مدخلات إضافية مثل الموائع الدقيقة (microfluidics)، أو سبر الخلايا، أو التلاعب الجيني ببروتينات معينة من أجل الإجابة على تساؤلات إضافية، مثل كيف تؤثر مجموعات من المحفزات على سلوك الخلايا الفردية وسلوكها في المستويات التنظيمية الأعلى؟