غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي من نوى دماغية محددة بطريقة قابلة للتكرار، ومتسقة، وفعالة من حيث التكلفة، وخالية من الـ RNA. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تجهيز بيئة عمل خالية من الـ RNA واستئصال الدماغ كاملاً من فأر مقطوع الرأس. بعد ذلك، يُستخدم قاطع أنسجة يعمل بالميكرومتر لقطع مقاطع نسيجية متسلسلة وبأحجام موحدة.

بعد ذلك، يتم إجراء تشريح مجهري لمناطق الدماغ المستهدفة باستخدام لُب نسيجي بقطر محدد مع الحفاظ على النسيج في بيئة وسط خالية من الـ RNA. وأخيراً، يتم عزل الـ RNA الكلي من نوى الدماغ المستأصلة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر حصيلة وجودة كافية من الـ RNA الكلي لإعداد مكتبة CDNA وتحليل الترانسكريبتوم من خلال فحوصات قياس الطيف الضوئي أو القياس الفلوري.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الاستئصال التشريحي العياني أو استئصال مناطق الدماغ بمساعدة مجهر الالتقاط بالليزر، في إمكانية جمع مناطق دماغية متعددة ومنفصلة تهم الباحث من دماغ فأر واحد بطريقة قابلة للتكرار وبتكلفة مناسبة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علوم الأعصاب، مثل ما إذا كانت أنماط التعبير النسخي المتميزة داخل مناطق الدماغ المرتبطة بدارات عصبية معينة قد تكون مرتبطة بسمات سلوكية أو استجابات بيئية أو حالة مرضية معينة. للتحضير لعملية التشريح الدقيق، يتم تزويد 100 milliliters من محلول إيرل الملح المتوازن أو EBSS بـ 0.44 grams من بيكربونات الصوديوم و 0.884 grams من الجلوكوز.

عالج محلول EBSS بـ 0.1 milliliters من DEPC في زجاجة أو دورق قابل للتعقيم بجهاز الأوتوكلاف ومزود بسدادة لولبية لمدة 12 ساعة على الأقل، عند درجة حرارة 37 °C. ضع ماصات زجاجية بطول five and three quarter inches في بيكر زجاجي سعة one liter، وضع فرش رسم بحيث تكون الشعيرات متجهة للأعلى في مخبار مدرج زجاجي سعة 100 milliliters.

أضف كمية كافية من محلول الماء المعالج بـ DEPC لتغطية الماصات والفرش. غطِّ الكأس والمخبار المدرج بورق الألومنيوم واتركهما في الحاضنة لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. بعد فترة الحضانة التي استمرت 12 ساعة مع DEPC، قم بتسخين جميع المواد المعالجة بـ DEPC إلى درجة حرارة أعلى من 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. برد محلول EBSS في درجة حرارة الغرفة قبل تخزينه عند 4 درجات مئوية.

قم بسكب DD H2O من البيكر والمخبار المدرج وواصل تحضينهما في درجة حرارة أعلى من 100 °C حتى تجف المواد. قم بإخراجهما من المحضنة، واتركهما ليبردا في درجة حرارة الغرفة ثم خزنهما للاستخدام لاحقًا. في يوم التجربة، قم بمعالجة جميع أسطح العمل لإزالة تلوث RNAs، وضع محلول EBSS في حمام مائي مضبوط عند 40 °C لضمان التخزين المؤقت والأكسجة.

يتم تشبيع محلول EBSS بـ 5%CO2 و 95% أكسجين عن طريق وضع أنبوب الغاز في ماصة باستور خالية من RNA. وبعد إدخال الماصة في محلول EBSS، يتم تغطية فتحة وعاء EBSS. ثم يتم إعداد جهاز تقطيع الأنسجة لإجراء تقطيع متسلسل لأنسجة الدماغ.

قم بمعالجة السطحين العلوي والسفلي لقطاعة الأنسجة. ولإزالة التلوث بالـ RNAs، قم بتثبيت قطعة مستطيلة من ورق الترشيح Watman Number four على السطح البلاستيكي (plexiglass) لقطاعة الأنسجة. ثم قم بتثبيت شفرة حلاقة مزدوجة الحواف على ذراع القطاعة.

اضبط الميكرومتر على الصفر، ثم عدّل الارتفاع الأدنى لذراع القاطعة للسماح لشفرة الحلاقة بقطع ورق الترشيح، دون قطع لوح البلكسي جلاس. اجمع كافة المواد الإضافية اللازمة للتشريح الدقيق، بما في ذلك أطباق زرع الخلايا الخالية من RNA بحجم 60 في 15 مليمتر، ورؤوس ماصات دقيقة خالية من RNA سعة 200 µL، ومقصات منحنية، وجليد جاف، وأنابيب لجمع الأنسجة. ضع الأنابيب على الجليد الجاف بعد قطع رأس الفأر باستخدام مقصلة القوارض وإزالة الدماغ كاملاً مع الإبقاء على كل من الدماغ الخلفي والأعصاب البصرية سليمة.

ضع الدماغ في الجزء العلوي من طبق زراعة خلايا خالي من الـ RNAs بمقاس 60 في 15 مليمتر. ثم انقله إلى سطح عمل أخذ عينات الأنسجة. استخدم ماصة خالية من الـ RNAs لترطيب ورق الترشيح المثبت بجهاز تقطيع الأنسجة بحذر باستخدام EBSS.

قم بترطيب أنسجة الدماغ باستخدام EBSS. انقل الدماغ إلى قطاعة الأنسجة ووضعه بحيث يكون السطح البطني مستنداً على ورق الترشيح، مع جعل الخط المنصف عمودياً على شفرة القطاعة والحافة المنقارية للدماغ ملاصقة للشفرة.

استخدم فرشاة رسم معالجة بـ A-D-E-P-C لتثبيت الدماغ في مكانه عن طريق تسليط ضغط خفيف على السطح الظهري للدماغ أثناء إبقائه ثابتاً. ارفع رافعة حامل الشفرة حوالي أربعة إلى خمسة سنتيمترات فوق سطح النسيج الظهري وثبتها في هذا الموضع. أزل الفرشاة من سطح الدماغ واضبط المقياس على 750 micrometers.

باستخدام الميكرومتر، اترك الرافعة لتسقط لتقطيع النسيج وإنشاء مقطع إكليلي بسمك 750 micrometer بينما تظل شفرة القاطع ثابتة. استخدم حركة دائرية بفرشاة الرسم لإزاحة مقطع النسيج برفق عن سطح الشفرة.

ضع المقطع النسيجي فوراً في محلول EBSS المؤكسج في طبق بيتري. هذه الشريحة الآن جاهزة للتشريح المجهري. كرر إجراء التقطيع حتى يتم الحصول على مقاطع دماغية متسلسلة عبر المستوى الأنفي الذيلي (rostrocaudal plane) بالكامل لإجراء التشريح المجهري.

أولاً، تحقق من الإضاءة لضمان عدم إعاقة إنارة العينة. اضبط موضع وتدفق خليط O2 CO2 للحفاظ على بيئة مؤكسجة ومنظمة للأنسجة. أثناء الإجراء، حدد المقطع الإكليلي للدماغ الذي يتضمن المنطقة المستهدفة، وباستخدام فرشاة رسم، قم بتوجيهه ليكون مسطحاً في قاع طبق بتري.

اختر مخرزة الأنسجة ذات القطر المناسب. ثبّت مقطع النسيج الإكليلي في مكانه باستخدام فرشاة الرسم، ثم أنزل طرف القطع الخاص بمخرزة الأنسجة فوق سطح المقطع النسيجي. ومع تطبيق الضغط، اضغط بطرف مخرزة الأنسجة عبر المقطع النسيجي وصولاً إلى قاع طبق بيتري بإحكام.

استخدم حركة دائرية تدويرية لضمان انفصال المنطقة المستهدفة عن الأنسجة المحيطة. ارفع لب النسيج بعناية بعيداً عن مقطع النسيج وحرر الخرم الدقيق (micro punch) بحيث يطفو في محلول EBSS باستخدام فرشاة رسم. ضع الخرم الدقيق للنسيج فوراً في أنبوب تخزين مستقر عند درجة حرارة -80 °C محفوظ على الثلج الجاف.

يجب أن يلتصق النسيج بسهولة بجانب الأنبوب. أعِد الأنبوب الذي يحتوي على عينة التشريح الدقيق إلى الثلج الجاف. كرر عملية التشريح الدقيق هذه لكل منطقة من مناطق الدماغ المستهدفة.

بمجرد اكتمال عملية التشريح الدقيق، سجل الملصق أو الرموز الشريطية الخاصة بكل أنبوب يحتوي على عينة. ضع عينات الأنسجة في مجمد بدرجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت استخلاص الـ RNA لاستخلاصه من عينات الأنسجة. أولاً، قم بتجهيز مساحة عمل خالية من الـ RNA.

قم بتحضير كمية كافية من خليط الخرز المغناطيسي ومحلول الربط والتحلل كما هو موضح في دليل مجموعة عزل الـ RNA الكلي. أخرج عينات الأنسجة من المجمد عند درجة حرارة -80 °C وضع الأنابيب مباشرة على الثلج الجاف. أضف 100 µL من محلول الربط والتحلل إلى أنبوب العينة.

ثبّت مدقة متوافقة مع أنبوب سعة 0.5 ملليلتر وخالية من النوكلياز في خلاط الرواسب، ثم قم بتجنيس النسيج باستخدام رأس ماصة خالية من النوكلياز ومنخفضة الاحتفاظ. انقل العينة المجنسة فوراً إلى عين في طبق زراعة أنسجة بـ 96 عيناً ذات قاع مستدير باستخدام نفس نوع رأس الماصة. أضف 60 µL من isopropanol بتركيز 100% إلى العينة.

أضف 20 µL من خليط الخرز إلى العينة واخلطها عن طريق السحب والضخ بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات. اتبع خطوات بروتوكول طقم عزل RNA الكلي لإتمام عملية استخلاص RNA الكلي. وأخيراً، قم بقياس نقاء وتركيز RNA الكلي الناتج. تظهر بيانات RNA الكلي المستخلص من ثقوب دقيقة لمناطق مختلفة من الدماغ في هذا الجدول.

وفرت عينات الـ RNA المذابة في 30 µL من محلول elution Buffer كمية كافية من الـ RNA الكلي لاستخدامها مع منتجات تحضير الـ cDNA المتوفرة تجارياً لتطبيقات تسلسل الـ RNA. بالإضافة إلى ذلك، فإن حصيلة الـ RNA ونسب 260 إلى 280 هي قيم فردية تم الحصول عليها من عينات التشريح الدقيق المعنية لتوضيح القراءات المستخلصة من كل منطقة في الدماغ، وهي تؤكد النقاء العالي للعينات. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون 8 إلى 10 دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تقليل مخاطر تلوث أسطح العمل أو عينات الأنسجة بالـ RNA من خلال استخدام المواد الخالية من الـ RNA أو المعالجة بـ DEPC فقط.