العزلة وتوصيف هويشت ^منخفضة CD45 ^{السلبية} ماوس خلايا الرئة الجذعية الوسيطة

يوضح هذا الفيديو بروتوكولاً لعزل الخلايا الجذعية الميزنشيمية الرئوية سالبة CD 45 المنخفضة من العائل. تُعد الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSCs) المقيمة في الأنسجة منظمات هامة لإصلاح الأنسجة أو تجديدها، والتليف، والالتهاب، وتكون الأوعية الدموية. أولاً، يتم تشريح الرئتين من فأر تم التضحية به.

يتم هضم أنسجة الرئة للحصول على معلق من الخلايا المفردة. وتُصبغ الخلايا بصبغة hoax وCD 45، ثم يتم فرزها بواسطة قياس التدفق الخلوي للحصول على خلايا جذعية ميزنكيمية (MSCs) من الرئة تكون سالبة لـ CD 45 ومنخفضة في المضيف. بعد ذلك، يتم تكثير الخلايا الجذعية الميزنكيمية للرئة في المزرعة، ويُجرى اختبار تشكيل المستعمرات لتقييم قدرات التمايز لهذه الخلايا الجذعية الميزنكيمية.

يمكن بعد ذلك إجراء دراسات إضافية لفحص دور الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) أثناء التوازن النسيجي والمرض. يمكن استخدام الطريقة التي نعرضها هنا لعزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية الرئوية سواء من الفئران أو البشر، ويمكن تطبيقها في دراسة أمراض الرئة مثل التليف الرئوي، وارتفاع ضغط الدم الرئوي، ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات بسبب تنوع الطرق المتاحة لتحضير الأنسجة، بالإضافة إلى إعداد جهاز قياس التدفق الخلوي وضوابطه المناسبة وعملية التحليل.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة وصف التقنية الصحيحة لفرم وهضم أنسجة الرئة لضمان الحصول على أفضل حيوية للخلايا باستخدام الكلمات وحدها. كما أن إعداد جهاز قياس التدفق الخلوي وتحليلاته يتم توصيلهما بشكل أفضل من خلال العرض التوضيحي. ابدأ هذا البروتوكول باستئصال الرئتين اللتين ستُستخدمان للحصول على الخلايا الجذعية الميزنشيمية من فأر بالغ تم التضحية به.

استخدم مقصاً صغيراً وحاداً لقص القفص الصدري جانبياً على كل جانب من جانبي الفأر. افتح التجويف الصدري، ثم قم بإزالة الحجاب الحاجز. أدخل حقنة سعة 10 milliliter مع إبرة بقياس 20.5 gauge في البطين الأيمن للقلب واضغط بلطف على المكبس لترويحه بـ 3 إلى 5 milliliters من PBS، وذلك لشطف الدم من الرئتين.

بعد ذلك، استخدم المقص لقص الرغامى والشعب الهوائية الكبيرة والتخلص منهما. ثم باستخدام الملقط، ارفع فصوص الرئة البيضاء الصغيرة وضعها في طبق بتري مملوء بمحلول هانكس الملح المنظم أو HBSS.

بعد ذلك، قم بإزالة القلب وفصل فصوص الرئة. كرر هذه العملية لجميع الفئران المشاركة في الدراسة. ثم انقل فصوص الرئة إلى غطاء الطبق.

قم بترطيب الأنسجة بكمية كافية من HBSS لمنع جفافها. ثم باستخدام مشرط قابل للتخلص منه، قم بتقطيع فصوص الرئة للحصول على نخاع العظم لاستخدامه كعنصر تحكم مستدام في قياس التدفق الخلوي. استخدم مقصاً حاداً للقطع عند الكاحل وأعلى عظمة الفخذ.

ضع الطرف في طبق بتري جديد. ثم اقطع الركبة، بحيث تترك قطعة طولية من عظم الفخذ وقطعة ثانية تحتوي على عظم الظنبوب وعظم الشظية. وباستخدام الملاقط، قم بإزالة العضلات للكشف عن عظم الظنبوب وعظم الشظية وعظم الفخذ.

الآن، خذ حقنة سعة 5 mL مع إبرة عيار 26.5، وأدخل الإبرة في فتحة نخاع العظم. عند أحد طرفي عظمة الظنبوب (tibia)، أمسك العظمة مع توجيه الطرف الآخر نحو أنبوب مخروطي سعة 50 mL مملوء بـ 15 mL من محلول HBSS، ثم اضغط على المكبس لصرف محلول HBSS وغسل نخاع العظم داخل الأنبوب. كرر هذه العملية مع عظمة الشظية (fibula) وعظمة الفخذ (femur).

قم بصبغ نخاع العظم بصبغة host 3 3 3 4 2 بتركيز نهائي قدره 5 µg/mL في وسط DMEM عالي الجلوكوز والمُدعم. بعد ذلك، سيتم تحضير معلق خلوي أحادي من أنسجة الرئة المستخلصة. ضع كل رئة في أنبوب يحتوي على محلول Worthington بتركيز 0.2% مُدفأ مسبقاً.

يتم تحضير الكولاجينيز من النوع الثاني في محلول HBSS معقم، ثم يُغمر الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ويُحضن لمدة 30 دقيقة. بعد عملية التحضين، تُستخدم ماصة سعة 10 مل لعمل عملية التقطير (trituration) للعينة حتى تتدفق المادة المهضومة بسهولة عبر الماصة. يتم تكرار ذلك 10 مرات تقريباً، ثم تُحضن العينة لمدة 15 دقيقة إضافية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لإتمام عملية هضم الأنسجة.

بمجرد اكتمال عملية الهضم، خفف معلق الخلايا باستخدام HBSS واستخدم ماصة سعة 5 mL للمحاولة مرة أخرى في تشتيت أي شظايا نسيجية متبقية. بعد ذلك، ولإزالة شظايا الأنسجة غير المهضومة، صب المعلق عبر مصفاة خلايا بمسام 70 µm في أنبوب مخروطي سعة 50 mL. أضف المعلق تدريجياً للسماح للعينة بالتدفق عبر مصفاة الخلايا.

إذا أدت قطع الأنسجة غير المهضومة إلى سد تدفق معلق الخلايا تماماً، فقم بتصفيته عبر مصفاة خلايا جديدة في أنبوب جديد. ثم قم بترسيب معلق الخلايا لمدة 10 دقائق عند 450 RCF.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بسحب السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا بلطف في محلول منظم لتحلل كريات الدم الحمراء في درجة حرارة الغرفة، ثم حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف حجماً مساوياً من HBSS لإبطال مفعول محلول التحليل.

صب معلق الخلايا في مصفاة خلايا بقطر 40 ميكرومتر لإزالة الحطام والتجمعات الخلوية، مع تجميع السائل المنساب في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر. بعد ذلك، وباستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، حدد أعداد الخلايا لكل من عينات الرئة ونخاع العظم. سجل التركيز والحجم الكلي لمعلق الخلايا.

ثم قم بترسيب معلق خلايا الرئة المفردة عن طريق الطرد المركزي عند 450 RCF لمدة 10 دقائق. وللحفاظ على الخلايا، أعد تعليق كل من خلايا الرئة ونخاع العظم معاً بتركيز 10⁶ خلية/مل في وسط DMEM عالي الجلوكوز المضاف إليه المكملات والمسخن مسبقاً.

لصبغ الـ DNA، أضف صبغة HOAXED 3 3 3 4 2 بتركيز نهائي قدره five micrograms per liter. بعد ذلك، اخلط الخلايا عن طريق القلب اللطيف وحضنها في حمام مائي عند 37 °C لمدة 90 دقيقة بالضبط. ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 450 Gs عند 4 °C بعد انتهاء عملية الدوران.

باشر بصبغ أنسجة الرئة ونخاع العظم باستخدام anti CD 45 ويوديد البروبيديوم استعداداً للتحليل بواسطة قياس التدفق الخلوي. وبمجرد صبغ الخلايا، تُحفظ الأنابيب على الثلج في مكان محمي من الضوء حتى يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. استعد لقياس التدفق الخلوي من خلال التأكد من محاذاة ليزرات الجهاز وأنه مُعد لفرز الخلايا.

يجب أن يكون الجهاز المستخدم مجهزاً بليزر أزرق بطول موجي 488 nanometer، وليزر أحمر بطول موجي 635 nanometer، وليزر UV بطول موجي من 350 إلى 355 nanometer، مع وجود كاشفين في مسار ليزر UV مع مرشحات زرقاء 45 over 65 ومرشحات حمراء 6 75 over 50. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتميز الكاشف الأحمر لليزر UV بحساسية عالية للإشارة الحمراء، كما يجب أن يكون الجهاز مجهزاً بوحدة تبريد للحفاظ على العينة عند درجة حرارة 10 °C. وفي إعدادات برنامج الجهاز، يتم ضبط مخططات المدرج التكراري لعرض تشتت الضوء الأمامي الخطي مقابل التشتت الجانبي، ومخطط تمييز المزدوجات المناسب للجهاز.

مخطط مدرج تكراري لـ PI باستخدام إشارة لوغاريتمية، ومخطط مقارنة باللونين الأحمر والأزرق باستخدام إشارات خطية، ومخطط مدرج تكراري لـ CD 45 A PC باستخدام إشارة لوغاريتمية. بمجرد أن يصبح الجهاز جاهزاً، ضع عينة نخاع العظم المصبوغة في منفذ التحميل الخاص بالجهاز. تُستخدم هذه العينة كعنصر تحكم لضبط الصبغ وإعداد الجهاز.

ابدأ في جمع الأحداث واضبط إشارات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي الخطي. ولتصوير مجتمع الخلايا بوضوح، يجب أن تقع الخلايا تقريبًا في المركز السفلي من المخطط، حيث يمثل التشتت الأمامي محور x. وبما أن صبغة النواة PI نفوذة عبر الغشاء، فسيتم استبعادها من الخلايا الحية.

قم برسم منطقة بوابة (gate) على الخلايا الميتة الإيجابية لصبغة PI في مدرج PI التكراري. ثم وجّه برنامج الجهاز لتلوين الخلايا الميتة الموجودة في هذه البوابة باللون الأحمر.

من المفيد استخدام الخلايا الميتة المصبوغة باللون الملون كدليل لتحديد مجموعة الخلايا في طور G0/G1 للمضيف. كما يتم تحفيز صبغة PI بواسطة ليزر UV، ويجب أن تظهر معظم الخلايا الميتة خارج نطاق القياس. وفي الجانب الأيمن من مخطط الفلورسنت للمضيف (الأحمر مقابل الأزرق)، يجب أن تظهر مجموعة G0/G1 لنخاع العظم كعنقود كثيف من الأحداث في مخطط الفلورسنت للمضيف (الأحمر مقابل الأزرق).

اضبط جهود الكاشف لوضع تجمع G zero G one في الجزء العلوي الأيمن من مركز المخطط. قد يكون جزء من المرحلة S وكامل المرحلة G two من الدورة الخلوية خارج نطاق المقياس. في الجزء العلوي الأيمن من مخطط red versus blue hoaxed، ستظهر المجموعات السكانية الجانبية ذات الكثافة المنخفضة وهي تمتد من الجانب الأيسر لتجمع G zero G one نزولاً إلى الزاوية السفلية اليسرى من المخطط.

الآن قم برسم بوابة حول التجمع الخلوي في مخطط FSC مقابل SSC. قم بتمثيل مجتمع الخلايا المفردة (singlet population) الذي تم تحديده في مخطط الثنائيات (doublet plot) والخلايا الحية في مدرج PI التكراري. بعد ذلك، قم بتعيين مخطط hoax لعرض هذه المجموعات المحددة بالبوابات فقط.

بعد تحديد البوابات في المخطط المضيف، ارسم منطقة حول المجموعة الجانبية. عيّن هذه المنطقة كبوابة لمخطط CD 45 A PC التكراري، إلى جانب بوابات الخلايا المفردة ذات التشتت الضوئي والخلايا الحية. الآن وبعد إعداد النظام، قم بإزالة العينة من منفذ التحميل وضع عينة الرئة في منفذ التحميل.

لا ينبغي أن تتطلب إعدادات الجهاز ضبطاً إضافياً لهذه العينة. ابدأ بجمع الأحداث على مخطط التمييز بين اللونين الأحمر والأزرق. عادةً ما تظهر مجموعة G zero G one لعينة الرئة أكثر استطالة في اتجاه المحور x وتشبه رمز التلدة (tilda) الموجود في لوحة المفاتيح.

يجب أن يكون بوابة فرز المجموعة الجانبية منخفضة في وضع مشابه لذلك المحدد لعينة نخاع العظم. قد تكون تلك التعديلات الطفيفة صعوداً أو هبوطاً ضرورية لضمان دقة فصل المجموعة الجانبية. حافظ على فرق ضغط منخفض أثناء الفرز من خلال التأكد من عدم فتح صمام تدفق العينة بشكل مفرط.

لعزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC)، ضع لوحة تجميع ذات 96 بئراً في غرفة الفرز، وقم بضبط بوابات الفرز على مخطط توزيع CD 45 A PC لفصل التجمعات الإيجابية والسالبة. وأخيراً، اجمع الخلايا إما كمجموعة مختلطة في أنبوب أو كخلايا مفردة لعزل المستنسخات في لوحة ذات 96 بئراً. بعد جمع الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) من الرئة عن طريق فرز الخلايا، يتم استزراع الخلايا في أطباق قطرها 30 مليمتر باستخدام وسط A MEM مدعم بـ 20% FBS. في البداية، تظهر الخلايا المفروزة صغيرة ومستديرة ولامعة بعد مرور أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع تقريباً.

تصبح المستعمرات ذات النمط الميزنشيمي واضحة، ويكون التكاثر أكثر جلاءً لكل تحضير خلوي. قم بتقييم قدرة الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSC) المستخلصة من الرئة على التمايز إلى السلالات الميزنشيمية التقليدية وهي الخلايا osteoblast، وadipocyte، وchondrocyte، وكذا تقييم تعبير سطح خلاياها عن العلامات الميزنشيمية المعتمدة. أجرِ تحليل النطاقات الخلوية (cytogenetic banning analysis) للتأكد من عدم وجود تشوهات صبغية جسيمة.

بعد العزل بواسطة قياس التدفق الخلوي وتوليد مستنسخات من خلايا مفردة، يتم إجراء مقايسة تكوين المستعمرات لتوصيف خلايا MSC وقدراتها على التمايز. ابدأ بخلايا مخففة إلى 3 × 10⁴ خلية لكل مليلتر. في أطباق قطرها 100 مليمتر تحتوي على وسط زراعة غير مكتمل، قم بإجراء تخفيف تسلسلي ليكون 2.6 × 10⁴، و3 × 10⁴، و1.5 × 10⁴، و0.75 × 10⁴ خلية لكل طبق في 10 مليلتر من الوسط، وذلك في ثلاث مكررات.

ثم ضع الأطباق في الحاضنة بعد 10 أيام من الزرع، وقم بسكب الوسط الغذائي وشطف الخلايا باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بتثبيتها عن طريق إضافة 100% methanol لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور خمس دقائق، قم بسكب methanol.

ثم للكشف عن تكوين المستعمرات، أضف GZA بتركيز 0.4% وزن/حجم مخفف بنسبة 1 إلى 20 بالماء المتأين، ثم حضن العينات لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بسكب الصبغة واشطف العينات بالماء المتأين. اترك العينات لتجف في الهواء، ثم قم بحساب عدد المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 25 خلية لكل مستعمرة باستخدام مجهر مقلوب أو نظام تصوير.

تظهر المستعمرات بحجم كبير وتتكون من بضع مئات من الخلايا كما هو موضح هنا، وتُظهر نمطاً ظاهرياً ميزنكيماً. تم عزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) كما هو موضح في هذا الفيديو وتم زرعها في أطباق ذات 96 بئراً لمحاكاة النمو. بعد ذلك، تمت إضافة خلايا مقدمة للمستضد مُعلمة بـ CFSE وموقوفة النمو إلى الخلايا الجذعية الميزنكيمية الرئوية.

تم قياس تكاثر الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) المعزولة بعد ذلك على أساس الانخفاض في متوسط شدة الفلورة لـ CFSE مقارنة بالخلفية، والتي تمثلت في الخلايا التائية الملحقة بـ CFSE وحدها كما هو موضح في هذا الشكل؛ ففي غياب الخلايا الجذعية للرئة ووجود الخلايا المقدمة للمستضد (APC) زائد أو ناقص OVA والخلايا التائية المؤثرة الإيجابية لـ CD40، يظهر انخفاض في شدة CFSE، مما يشير إلى حدوث التكاثر الموضح بالدائرة الحمراء. تنخفض شدة فلورة CFSE لغشاء الخلية التائية هندسياً مع كل انقسام خلوي، أي بمقدار النصف مع كل انقسام. أما في وجود الخلايا الجذعية الميزنكيمية للرئة (lung MSC) و APC زائد أو ناقص OVA والخلايا التائية المؤثرة الإيجابية لـ CD40، فلا يظهر أي تغيير ملحوظ في شدة CFSE، مما يشير إلى عدم حدوث تكاثر بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية للرئة لاستكشاف دور الخلايا الجذعية الميزنكيمية في أمراض الرئة مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي والتليف الرئوي.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون خمس ساعات تقريبًا باتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل اختبارات التمايز للإجابة على تساؤلات إضافية، بما في ذلك ما إذا كانت الخلايا الجذعية الميزنشيمية الرئوية المفترضة تظهر تمايزًا مناسبًا لعدة سلالات، وقدرة على التحول إلى عظم ودهون وغضروف.