غشائي ذاتي السلف الخلوي البذر التكنولوجيا واختبار توافق مع الحياة للحصول على أجهزة القلب والأوعية الدموية في نموذج حيواني كبير

الهدف العام من هذه التجربة هو استزراع غرسات وعائية بخلايا سلفية بطانية مشتقة من دم ذاتي، ثم مراقبة تأثير هذه المعالجة على التخثر في نموذج حيواني كبير. ويتم تحقيق ذلك من خلال الحصول على عينة دم محيطية من الخنازير لعزل الخلايا السلفية البطانية الخنزيرية ذات النمو المتأخر. بعد ذلك، يتم استخدام جهاز قابل للغرس.

في دراستنا لإثبات المبدأ، يتم وضع الخلايا الجذعية السلفية البطانية (PCs) ذاتية المنشأ داخل أنبوب تيتانيوم. بعد ذلك، يتم زرع الجهاز في الوريد الأجوف السفلي للخنزير. وتظهر النتائج وجود حماية ضد التخثر بناءً على نفاذية أنبوب التيتانيوم المبطن بـ EPC مقارنة بالمجموعة الضابطة وأنبوب المعدن العاري المسدود.

تلتزم جراحة ديوك بتعزيز الأبحاث الرائدة والمبتكرة. ويعد العرض التقديمي التالي مثالاً على كيفية عملنا عبر الأقسام والتخصصات المختلفة لتطوير الطب. لقد قاد الدكتور EK جهداً بحثياً لتطوير تقنية تثبيت الخلايا التي ستعمل على منع التخثر عن طريق تبطين السطح الملامس للدم في الأجهزة الوعائية بالخلايا السلفية الخاصة بالمريض.

بما أن هذه الخلايا قد اشتُقَّت من المرضى أنفسهم الذين سيتلقون الزرعة، فإننا نتجنب رفض الجهاز المناعي لها. إن نجاحنا والطرق الموضحة هنا هي ثمرة جهد جماعي كبير. وسيقوم بتقديم عرض توضيحي لعملية الزرع الجراحية كل من شون غيج من قسم جراحة الأوعية الدموية، وويتني لين، طالب الطب بجامعة ديوك، وأنا.

أود الآن أن أقدم لكم ألكسندر يانسن، طالب الدكتوراه من قسم الهندسة الطبية الحيوية، الذي سيصحبنا في تفاصيل عملية استزراع الخلايا. سأقوم بتوضيح كيفية استزراع أنابيب التيتانيوم بالخلايا السلفية البطانية المشتقة من الدم مباشرة قبل زراعتها في نموذج خنزير. وتعمل هذه الطريقة كإثبات للمفهوم، حيث يمكن تطبيق المبادئ الأساسية ذاتها على العديد من الأجهزة القابلة للزرع الأخرى، مثل دعامات النيتينول وأجهزة المساعدة على الدورة الدموية الميكانيكية. يتم عزل EPCs عن طريق زراعة جزء الخلايا أحادية النواة من دم الخنازير، وتظهر عادةً بعد حوالي سبعة أيام.

يمكن التعرف عليها من خلال شكلها المورفولوجي النموذجي الذي يشبه رصف الطريق. قم بتنمية الخلايا السلفية البطانية (EPCs) حتى يصل العدد الإجمالي إلى 9 مليون خلية في المزرعة. اشطف الخلايا السلفية البطانية (EPCs) المُحضّرة مرتين في وسط خالٍ من المصل، مع الحرص على الحد من تعرضها للضوء أثناء وبعد عملية الوسم.

بعد ذلك، قم بتغطية الخلايا بعلامة فلورية، PKH 26، وسجل كمية المحلول المستخدمة. حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. أوقف تفاعل الوسم بإضافة حجم مساوٍ من مصل الخنزير إلى محلول الصبغة بعد دقيقة واحدة.

قم بتخفيف المحاليل المدمجة بنسبة واحد إلى واحد باستخدام وسط نمو كامل. بعد ذلك، اسحب السائل واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام وسط نمو كامل، يتبع ذلك غسلتان باستخدام DPBS خالي من كلوريد الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد ذلك، غطِّ الخلايا بمحلول trypsin مع تدوين الحجم المستخدم، ثم قم بتحضينها عند 37 °C.

بعد ثلاث دقائق من الحضن، استخدم المجهر للتأكد من انفصال الخلايا، وفي حال حدوث ذلك، أضف ضعف كمية محلول تحييد التربسين التي تمت إضافتها سابقاً. بعد تحييد التربسين، ادمج محاليل الخلايا في أنبوب واحد وقم بقياس كثافة الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). وأخيراً، قم بترسيب معلق الخلايا وإعادة تعليق الخلايا في 4.5 milliliters على الأقل من الوسط الخالي من السيروم.

بعد تحضير الخنزير للجراحة، يتم إجراء شق في الخط الناصف باستخدام شفرة مشرط رقم 15 بدءاً من المجموعة الثانية من الغدد الثديية. يتم التوسع وصولاً إلى المجموعة قبل الأخيرة بحذر باستخدام الكي الكهربائي. استمر في عملية التشريح وصولاً إلى اللفافة البطنية.

ارفع البريتون باستخدام ملقط mosquito، ثم ادخل فيه بعناية باستخدام مقص mets andal، وقم بإخراج المثانة البولية ووضع غرزة كيسية (purse string suture) من نوع Vicryl 3-0 في جدار المثانة. اصنع شقاً طعنياً في مركزها وأدخل قسطرة Foley بمقاس 16 French في الشق. بعد ذلك، قم بإعطاء السوائل عن طريق الوريد لضبط مخرجات البول لتكون 1 ml/kg/h على الأقل خلال الجراحة.

بعد ذلك، يتم إخراج الجزء المتضخم الصغير من الأمعاء للخارج ووضع مباعدين جراحيين من نوع bour لكشف الجانب الخلفي من التجويف البريتوني وتحديد الوريد الأجوف السفلي IVC باستخدام التشريح الحاد والروم، مع تحرير الوريد الأجوف السفلي IVC بعناية من الأنسجة المحيطة. ثم يتم تعرية الوعاء الدموي من الشريان الكلوي الأيمن بدءاً من المنطقة القريبة من تفرع الوريد الأجوف السفلي IVC وصولاً إلى المنطقة القاصية.

يجب توخي الحذر الشديد أثناء تشريح الوريد الأجوف السفلي (IVC)، حيث أن أي خلل بسيط جداً في الوريد الأجوف السفلي قد يؤدي إلى نزيف سريع واستنزاف دم الحيوان المربوط. يجب ربط جميع الفروع الجانبية لقطعة الوريد الأجوف السفلي، مع إيلاء عناية خاصة عند تشريح وربط الوريدين القطنيين الخلفيين الكبيرين الموجودين مباشرة قبل تفرع الوريد الأجوف السفلي. وغالباً ما يوجد وريد قطني كبير في الجانب الخلفي.

قم بتشريح هذا الوريد وتحريره ثم السيطرة عليه باستخدام حلقات الأوعية الدموية. الآن، وبالتوازي مع الجراحة، ابدأ باستزراع الغرسة بالخلايا السلفية البطانية EPCs قبل البدء في هذا الإجراء. يجب أن تكون ساندات أنسجة الأنابيب التيتانيومية مجمعة بالكامل وجاهزة للاستخدام في مجال معقم.

افتح مجموعة أنبوب التيتانيوم المعقمة بالغاز في محقنة سعة 5 cc. ثم قم بإزالة المكبس من المحقنة سعة 5 cc، ولكن لا تتخلص منه. قم بتثبيت غطاء الإغلاق في المحقنة. استخدم ماصة لملء المحقنة بمعلق EPC.

بعد ذلك، أعِد تركيب المكبس. قم بإزالة الغطاء وأدخل طرف المحقنة في أنبوب السيليكون المفتوح للتجميعة حتى يستقر بإحكام. دون المضي قدماً، قم بإزالة أي فقاعات عن طريق دفع محلول الخلية ببطء حتى يصل إلى الجزء العلوي من القطعة الرأسية.

بعد ذلك، أغلق التجميع باستخدام غطاء لور (lure cap) وأحكم إغلاقه بالشريط اللاصق داخل قفاز معقم. أدخل هذا التجميع بالكامل في حامل محقنة مُصنع آلياً وضعه في حاضنة عند درجة حرارة 37 degree Celsius. استخدم مقياساً للتأكد من استواء غرف التثبيت، واترك التجميع يحضن مع تدوير لطيف.

استكمل العملية الجراحية مباشرة بعد ربط الوريد الأجوف السفلي (IVC) عن طريق إعطاء 100 وحدة من الهيبارين لكل كيلوغرام من وزن الخنزير. ثم قم على الفور بوضع مشبك على الوريد الأجوف السفلي بزاوية 45 درجة في الجهة القاصية من الوريد الأجوف السفلي والوريد القطني، ثم في الجهة الدانية. بعد ذلك، استخدم شفرة مشرط رقم 11 ومقصات تشريح لإجراء شق وريدي طولي بطول أربعة سنتيمترات بين المشبكين الداني والقاصي.

قم بتفريغ أي دم من الوريد الأجوف السفلي (IVC) واغسل لُمعته الداخلية بمحلول DPBS المعقم. الآن، أدخل الغرسة المزروعة بخلايا EPC أو عينة تحكم من المعدن المجرد في الوريد الأجوف السفلي لمنع جفاف الخلايا ولتفريغ الهواء. املأ الوريد الأجوف السفلي بمحلول DPBS الذي يحتوي على كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم.

بعد ذلك، أغلق فتحة الوريد بغرزة مستمرة من البرولين 4-0، ثم قم بإزالة المشبك الداني لتفريغ الهواء من الوريد الأجوف السفلي (IVC) من خلال السماح بكمية صغيرة من النزيف المرتد. بعد النزيف، قم بإزالة المشبك القاصي لتثبيت الغرسة في مكانها. ثم ضع غرزة تثبيت في أنبوب PVC المار عبر جدار الوريد.

أغلق اللفافة باستخدام غرز OPDS على إبرة CT. ثم أغلق الحيز تحت الجلدي باستخدام غرزتين متصلتين من Vicryl. بعد ذلك، قم بإغلاق الجلد باستخدام الدباسات الجراحية.

يتم حقن ما يصل إلى 20 milliliters من Marcaine بتركيز 0.25% تحت الجلد على طول موقع الشق، وتغطية الجرح بالشاش وtegaderm لتخفيف الألم. يُعطى flu Nixon وoxymorphone تحت الجلد حسب الحاجة. يتم إيقاف التخدير، وعندما يستيقظ الخنزير، يُعاد إلى قفصه على مدار الأيام السبعة التالية.

يتم إعطاء atri كل 24 ساعة كوقاية بالمضادات الحيوية، مع التأكد من بقاء لاصقة fentanyl التي وُضعت قبل الجراحة ملتصقة لمدة ثلاثة أيام إجمالاً. وبعد مرور ثلاثة أيام، تمت إزالة غرسات الأنابيب التيتانيوم المثبتة وفحص الأسطح الداخلية. وتحت طول موجي للإثارة يبلغ 550 نانومتر، وُجدت طبقة متصلة من الخلايا المحددة بفلورسنت في أنبوب آخر.

صُبغت خلايا المقاطع بشكل إضافي باستخدام علامة التصاق الخلايا البطانية بالصفائح الدموية لتصور حدود الخلايا. ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأصباغ في هذا الإجراء. وفي المقابل، ينسد غرس أنبوب تيتانيوم مجرد تماماً في بيئة قصخفضة محفزة للتجلط في الوريد الأجوف السفلي.

كما هو موضح في الصورتين A و C، تظهر الأنبوبة التيتانيومية المثبتة للخلايا في الصورة B، وقد ظلت خالية من الجلطات بعد إجراء عزلنا للخلايا باستخدام دم الذروة. تظهر EPC بعد متوسط سبعة أيام في المزرعة. أثناء إجراء العملية الجراحية، من المهم جداً تشريح الوريد الأجوف السفلي (IVC) بعناية ورفق، لأن أي تمزق بسيط في IVC أو فروعه الجانبية قد يؤدي إلى نزيف حاد للخنزير. وبعد هذا الإجراء، يمكن للمواد الأخرى الملامسة للدم أن تكتسي ببطانة غشائية بسرعة لمنع حدوث التخثر.

إن الدعامات الوعائية البطانية، على سبيل المثال، باستخدام خلايا EPCs الخاصة بنا، تحاكي البطانة الأصلية لجدار الوعاء الدموي وقد تمنع إعادة تضيق الدعامة وتجلط الدم بعد تركيبها. ستسمح تقنية quick see الخاصة بنا بتبطين الأجهزة داخل الأوعية الدموية باستخدام الخلايا السلفية البطانية المشتقة من دم المريض نفسه في غضون دقائق داخل غرفة العمليات أو مختبر القسطرة. وبالتالي، يتم الاستغناء عن الزراعة المطولة خارج الجسم.

يتم تجنب قضاء الوقت على الجهاز نفسه، مما يجعل هذه التقنية عملية للتطبيق في الممارسة السريرية.