تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم C أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالتصور المباشر لنقص إنزيمات التنفس الميتوكوندرية في مقاطع نسيجية مجمدة حديثة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال جمع مقاطع باستخدام المبرد (cryostat) من العضو المعني. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إجراء الكيمياء النسيجية لإنزيم Cox، والتي تليها الكيمياء النسيجية لإنزيم SDH.

أخيرًا، يتم تجفيف قطاعات الأنسجة، ثم تثبيتها ووضع شريحة غطاء عليها. وفي النهاية، يمكن أن تُظهر النتائج مدى الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا من خلال كمية التلوين الأزرق الخلوي. مرحبًا. سنتحدث اليوم عن تقنية التلوين النسيجي الكيميائي المزدوج Cox SCH.

وبينما يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة أمراض الميتوكوندريا، فإنها يمكن أن توفر أيضاً رؤى حول الشيخوخة والاضطرابات المرتبطة بالسن. بعد استئصال الدماغ من حيوان تم التضحية به وفقاً للتصريح الأخلاقي، قم بتجميده بسرعة على الثلج الجاف. يمكن حفظ الأنسجة المجمدة في درجة حرارة 80- °C، ملفوفة بورق الألومنيوم حتى تصبح جاهزة للتقطيع.

قم بتجهيز النسيج للتقطيع بالتجميد عن طريق وضع الدماغ على قاعدة جهاز المقطعية بالتبريد (cryostat chuck) وإحاطته بمركب التضمين. ضع القاعدة بسرعة داخل جهاز المقطعية بالتبريد واجمع قطاعات بسمك 14 micron عند درجة حرارة -21 °C. قم بإذابة القطاعات على الشرائح باستخدام كتلة تسخين، ثم اترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

ضع الشرائح في غرفة صبغ الشرائح مع شرائط ورقية مبللة. ونظراً لأهمية أوقات التفاعل في هذا المقايسة، يُوصى بمعالجة 10 شرائح كحد أقصى في كل تجربة تحت غطاء كيميائي. قم بتحضير وسط الحضن الذي يحتوي على dab وcytochrome C في PBS وقم بمزجه بواسطة جهاز vortex.

أضف بسرعة 2 µg من CDEs البقرية إلى الوسط واخلط جيداً باستخدام جهاز الـ vortex. ولتفكيك جميع حبيبات CDEs بينما لا تزال تعمل داخل كبينة التدفق الصفحي، ضع من 150 إلى 200 µL من وسط الحضن على كل شريحة، واستخدم طرف الماصة لتوزيعه بالتساوي على جميع المقاطع. حضن الشرائح لمدة 40 دقيقة عند 37 °C.

بعد مرور 40 دقيقة، قم بإزالة وسط الحضن من الشرائح. اغسل الشرائح أربع مرات في محلول PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد غسل الشرائح، أعدها إلى غرفة تلوين الشرائح مع شرائط ورقية مبللة مع العمل تحت غطاء كيميائي.

قم بتحضير محلول NBT في محلول PBS مع الحرص على حماية PMS من الضوء، ثم قم برج المحلول سريعاً باستخدام جهاز vortext. أضف من 150 إلى 200 µL من محلول NBT إلى كل شريحة، وباستخدام رأس الماصة، وزع المحلول بالتساوي على جميع المقاطع. قم بحضن الشرائح لمدة 40 دقيقة عند 37 °C، وبعد مرور 40 دقيقة، قم بإزالة المحلول الزائد من الشرائح. اغسل الشرائح أربع مرات في محلول PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة.

قم بتجفيف الشرائح لمدة دقيقتين لكل منها في التركيزات المتتالية التالية من الإيثانول: 70%، و95%، و99.5%. وأخيراً، اترك الشرائح لمدة 10 دقائق في خطوة إضافية بتركيز 99.5%. ضع الشرائح في الزايلين لمدة 10 دقائق، ثم قم بتثبيتها باستخدام LAN وضع أغطية الشرائح.

اترك الشرائح لتجف طوال الليل أو لمدة ساعة إلى ساعتين على الأقل في منطقة جيدة التهوية هنا. تم وسم مقاطع من الدماغ لفئران من النوع البري وفئران MT.DNA Mutator التي تعاني من الشيخوخة المبكرة بالتتابع لقياس أنشطة COX وSDH.

يظهر نشاط Cox الطبيعي، والذي يشير إليه التلوين البني الداكن، في حصين الفئران من النوع البري. وقد تبين وجود نقص في نشاط Cox، يشير إليه التلوين الأزرق، في حصين الفئران من سلالة MT DNA mutator عند عمر 12 و46 أسبوعاً. ولوحظ انخفاض إضافي في نشاط Cox بحلول عمر 46 أسبوعاً في الفئران من سلالة M-T-D-N-A mutator، مما يشير إلى تفاقم واسع النطاق في خلل السلسلة التنفسية.

أدت فترات التحضين غير الكافية والتي بلغت 10 و 25 دقيقة إلى انخفاض ترسب ناتج تفاعل DAB البني. وقد سمحت فترات التحضين القصيرة بتكوين الناتج النهائي الأزرق لـ Foran أثناء تحضين SDH، مما أعطى إشارة مضللة بوجود خلايا تعاني من نقص في COX. كما أدى انزلاق الشرائح أثناء تحضين COX إلى تكوين وترسب غير دقيق لناتج تفاعل DAB.

على الرغم من إمكانية وسم أنشطة Cox وSDH بشكل فردي كما هو موضح هنا، فقد ثبت أن الوسم المتسلسل مفيد في تحديد الخلايا التي تعاني من خلل وظيفي في الميتوكوندريا. ويظهر مثال على ضابط النوعية لأنشطة COX وSDH في دماغ فأر من النوع البري وسماً سلبياً. لذا، لا تنسَ أن التعامل مع المواد الكيميائية في بروتوكول الوسم المزدوج Cox SCH خطير للغاية، ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء ملابس المختبر المناسبة وقناع الوجه، والعمل تحت غطاء سحب الغازات الكيميائية، وكذلك التخلص من وسط التحضين في كل مرة تجري فيها هذا المقايسة.