تعيين تباين التعبير البروتين في الأورام باستخدام المناعي الكمي

الهدف العام من التجربة التالية هو التحديد الكمي الدقيق لتعبير المؤشرات الحيوية عبر مقاطع نسيجية كاملة من سرطان بشري، وذلك بهدف تعيين قيمة عددية لدرجة التباين في التعبير البروتيني. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق مسح مقاطع من نسيج سرطاني مُوسومة مناعياً فلورياً باستخدام ماسح فلوري للشرائح الكاملة. بعد ذلك، يتم اختيار مناطق ذات أهمية داخل الورم لتقييمها.

بعد ذلك، يتم قياس تعبير البروتين المستهدف ضمن مناطق الورم الغازية باستخدام نظام aqua analysis للتحليل الآلي للصور. وفي النهاية، يمكن استخدام هذه الطريقة لرسم خريطة تعبير المؤشرات الحيوية في أنسجة السرطان، والتي غالباً ما تكون غير متجانسة للغاية عبر المقطع النسيجي. وتتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنيات مقارنة بالطرق التقليدية، مثل الكيمياء النسيجية المناعية التي تستخدم كواشف التصوير اللوني والمقاييس، في أن التألق المناعي أكثر كمية وأكثر حساسية.

يؤدي ربط هذه الطرق التحليلية بمسح كامل للمقطع باستخدام التألق المناعي إلى تمكين رسم خرائط دقيقة للتغيرات الطفيفة في تعبير المؤشرات الحيوية عبر الأنسجة. ولأول مرة، يقوم مارك غوستافسون، المدير المباشر للعمليات في مختبر Histo RX، باستعراض هذه الإجراءات. بعد استخدام المقطاع الدقيق (microtome) لتقطيع خزعة من نسيج سرطاني وإجراء صبغ تألق مناعي للعينة للكشف عن تعبير المؤشرات الحيوية المستهدفة، يتم تحميل ما يصل إلى خمس شرائح من المقاطع المصبوغة في كاسيت الشرائح الخاص بماسح الشرائح.

بعد ذلك، وباستخدام الواجهة في وحدة تحكم مجهر المسح (scan scope console)، قم بتحديد منطقة لكل شريحة بحيث تشمل جميع الأنسجة الموجودة عليها، بغض النظر عن نمط الصبغ أو أي جوانب أخرى يمكن ملاحظتها في العينة. ثم، وباستخدام وحدة تحكم مجهر المسح، قم أولاً بتحديد منطقة من النسيج لتقييمها، ويفضل أن تكون ضمن منطقة الورم في النسيج لتقديم أفضل تمثيل ممكن.

الآن، باستخدام ميزة التعريض الضوئي التلقائي في وحدة تحكم مجهر المسح، حدد وقت التعريض لكل قناة بالإضافة إلى تركيز الصورة، واستخدم الماسة الزرقاء الموجودة على صورة وحدة تحكم مجهر المسح لاختيار منطقة إضافية بعيدة عن النسيج، ولكنها لا تزال ضمن منطقة الشريحة الموجودة تحت الغطاء الزجاجي لتحديد منطقة الخلفية التي سيتم فيها الحصول على صور تصحيح الحقل المسطح. وبالنسبة لكل مرشح، أضف نقاط تركيز إلى منطقة النسيج، والتي تمثلها مربعات صفراء، لتحسين عملية التقاط الصور. وإذا ظهرت الصور بخلفية عالية أو ظهرت بها شوائب تصويرية أخرى، فيجب نقل منطقة الصورة والتقاط صور جديدة.

يتم بعد ذلك فحص النسيج، ثم تُرفع صور الشرائح الرقمية المكتسبة تلقائيًا إلى قاعدة بيانات Aperio spectrum. انقر نقرًا مزدوجًا على الصورة المصغرة في برنامج spectrum لاختيار الشريحة المراد تحليلها من قائمة الشرائح الرقمية في قاعدة بيانات spectrum. بعد ذلك، وباستخدام الصورة المرفقة الموضحة لـ h و D، قم بتحديد منطقة الاهتمام على الصورة الفلورية.

يمكن تحديد مناطق متعددة ذات أهمية مرسومة بدوائر فردية على عينة واحدة. يتم حفظ الصور المشروحة تلقائيًا في قاعدة بيانات الأطياف. الآن اختر Analyze من شريط القائمة في أعلى الشاشة، وعندما تظهر نافذة التحليل، اختر histo RX aqua analysis من القائمة المنسدلة.

عند الاستعداد للبدء، اضغط على زر التحليل (analyze)، حيث ستظهر نافذة وحدة تحكم مصغرة في شريط مهام Windows تعرض تقدم عملية نقل الصور من قاعدة بيانات Spectrum إلى الكمبيوتر المحلي. وبمجرد نقل البيانات، سيبدأ تشغيل برنامج aqua analysis لإنشاء درجة aqua باستخدام خوارزمية تسجيل aqua غير خاضعة للإشراف تعتمد على تجميع البيانات وفق عتبة عينة أولى، وهي إشارة صورة pan cytokeratin فوق إشارة صورة الخلفية. وسيتيح ذلك استخدام البكسلات لتحديد قناع الورم الذي يمكن استخدامه بعد ذلك في الحسابات اللاحقة.

استخدم البكسلات ذات التعبير العالي عن البان سيتوكيراتين (pan cytokeratin) لتحديد المناطق السيتوبلازمية أو غير النووية للخلايا الورمية أيضاً. وكما هو موضح هنا، فإن البكسلات التي تظهر إشارة عالية في قناة DPI والتي تقع ضمن قناع الورم يتم تحديدها على أنها ذات طبيعة نووية. وإذا تبين عند المراجعة وجود حقول غير مناسبة للتقييم بسبب عيوب في العينة أو في التصوير، يتم استبعاد تلك الحقول من التقييم، كما ستؤدي إلى نتيجة نهائية بالفشل.

تُمثَّل نتائج التقييم الرقمي (aqua scoring) في شكل جدول من الدرجات المرتبطة بكل بلاطة بكسل بمقاس 512 × 512 في المنطقة المستهدفة ضمن عينة مقطع نسيجي كامل، والتي يمكن حفظها واستخدامها في التحليل الإحصائي اللاحق. وتوضح هذه الصور المجهرية المصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوسين كيف يمكن أن تظهر مناطق مختلفة من نفس سرطان المبيض مورفولوجيا متغيرة. كما تسلط الرؤية عالية التكبير في أعلى يمين الشكل B الضوء على خلايا ذات تصفية سيتوبلازمية ونمط نمو صلب في الجزء العلوي من الورم.

ومع ذلك، فإن الجزء السفلي من النسيج المكبر في القسم السفلي الأيمن من الشكل C يتميز بسيتوبلازم حمضي أكثر تجانساً ونمط نمو حليمي. وهنا، تُظهر اللوحات العلوية والسفلية خرائط حرارية لعدم التجانس في تعبير ER في مقطع نسيجي لسرطان المبيض قبل وبعد العلاج الكيميائي على التوالي. لاحظ التغير من تعبير ER متغير عبر المقطع مع وجود مناطق ذات تعبير عالٍ ومنخفض في الشكل العلوي إلى توزيع متساوٍ لتعبير ER العالي الموضح باللون الأحمر في الشكل السفلي.

يُشار إلى التمثيل العددي لهذا التغيير على اليسار من خلال الانخفاض في مؤشر سيمبسون (Simpsons index). وتظهر في هذا الشكل الخرائط الحرارية لعدم التجانس لبروتين HER two في مقطع نسيجي من سرطان المبيض مرة أخرى قبل العلاج وبعده، كما هو موضح في اللوحتين العلوية والسفلية على التوالي. لاحظ مجدداً التغير من التعبير المتغير لبروتين HER two عبر المقطع، مع وجود مناطق ذات تعبير مرتفع ومنخفض في الشكل العلوي، إلى توزيع متساوٍ للتعبير المرتفع لبروتين HER two في الشكل السفلي.

ومرة أخرى، يُلاحظ انخفاض مؤشر سيمبسون (Simpsons index). وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن جودة البيانات الناتجة عن التحليل الحاسوبي تعتمد كلياً على جودة الصبغ، والتي يجب أن تكون وفق معيار تقني عالٍ.