الكمية مقارنة رابطة الدول المستقلة التنظيم العنصر (لجنة المساواة العرقية) في الأنشطة المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة السوداء البطن

الهدف العام من هذا الإجراء هو القياس الكمي لأنشطة التنظيم الجيني للعناصر التنظيمية CIS أو عناصر CRE النشطة أثناء التطور التحولي لذبابة drosophila melan gastro. ابدأ باستخدام طرق التكامل المحددة الموقع لإنتاج سلالات من عناصر CRE المدمجة عبر التحول الجيني كجينات تقريرية. باستخدام مجهر ستيريو، احصل على عينات متحولة جينياً في المرحلة التنموية الصحيحة.

قم بإزالة العينات من الأنبوب الخارجي وثبتها على شريحة مجهر زجاجية. تابع بتسجيل مستوى ونمط تعبير البروتين المراسل الفلوري في عينات التثبيت الكاملة باستخدام تحليل المجهر البؤري. وأخيرًا، قم بقياس مستوى تعبير البروتين المراسل الفلوري للصور البؤرية المسجلة باستخدام أداة برنامج Image J.

تحدد هذه النتائج مستوى النشاط التنظيمي للجينات للمساعدة في تحديد العناصر التنظيمية وتسهيل المزيد من دراسات التعبير الجيني المقارنة على نسخ معدلة من العناصر التنظيمية البعيدة (CRE). يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على أسئلة رئيسية تهم الباحثين في التنظيم الجيني وكيفية ترميز هذا التنظيم. كما يساهم الحمض النووي (DNA) في فهم البيولوجيا التطورية والبيولوجيا النمائية.

تم تطوير هذا الإجراء لتقديم رؤى حول العناصر التنظيمية cis التي تعمل أثناء التطور التحولي في ذبابة الفاكهة drosophila melanogaster. ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا الإجراء من حيث المبدأ على العناصر التنظيمية cis التي تعمل خلال مراحل نمائية أخرى وأنواع أخرى من ذباب الفاكهة، أو حتى في كائنات نموذجية أخرى. ومن أجل توسيع السلالات المعدلة وراثياً، يتم تجهيز قارورتين تحتويان على عدة ذباب من الذكور والإناث في أيام متبادلة.

انقل الذباب من إحدى الأنابيب إلى أنبوب جديد. كرر هذه العملية لمدة أسبوع. وبنهاية الأسبوعين، تحقق من أن ذباب الفاكهة المعدل وراثياً يشمل المراحل النمائية من اليرقات إلى البالغين.

ابدأ بتصنيف العينات في نهاية المرحلة اليرقية الثالثة عند تكوّن ER. لاحظ أن العينة تكون غير متحركة. يكون ER أبيض وليناً وتكون الكرات قد انحرفت، حدد هذه النقطة الزمنية.

عند الصفر HAPF. تم تمييز الذكور عن الإناث بوجود غدد تناسلية تقع على الجانبين بالقرب من منتصف الجسم، والتي تظهر كدوائر شفافة لتحديد المرحلة بناءً على طول التحول. عند الصفر HAPF، يتم نقل العينات إلى قارورة جديدة باستخدام فرشاة رسم مبللة.

أضف قطعة من منديل Kim wipe وبللها بالماء لمنع العينات من الجفاف. الآن، قم بتحضين الأنبوبة عند 25 degrees Celsius حتى الوصول إلى HAPF المطلوب. بدلاً من ذلك، يمكن تحديد مرحلة العينات عن طريق الفرز بناءً على تحديد وجود وموضع العديد من العلامات المورفولوجية كما هو مفصل في النص المصاحب.

باستخدام شريط لاصق للمختبر، ثبّت قطعة من شريط التعبئة على لوح التشريح بحيث يكون السطح اللاصق موجهاً للأعلى. بلل فرشاة تلوين واستخدمها لوضع الرطوبة على العينات، ثم انقل العينات إلى منديل Kim wipe.

انقل العينات إلى شريط التغليف وألصقها بحيث يكون السطح الظهري موجهاً للأعلى. اترك العينات لتجف لمدة 15 دقيقة. قم بفتح الشبكية (ER) تدريجياً باستخدام الملقط.

ابدأ من الطرف الأمامي أو الفم واتجه نحو الطرف الخلفي. بعد ذلك، انقل العينة إلى قطرة من زيت لزج على شريحة مجهرية وقم بتقييم العينة مجهرياً بالنسبة للعينات المثبتة كاملة. استخدم إما العدسة الشيئية 4x أو 10x لضبط بؤرة العينة.

باستخدام برنامج المجهر البؤري، اضبط الطول الموجي للإثارة للبروتين الفلوري المطلوب لمنع التبييض الضوئي. ابدأ بكثافة ليزر تتراوح بين 5% إلى 10%. إذا كانت الإشارة ضعيفة، فقم بزيادة الكثافة حسب الحاجة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. بالنسبة للصور البؤرية، قم بتفعيل إعدادات البرنامج التي تقوم بحساب متوسط قياسات البكسل من عمليات مسح مكررة، مثل متوسط كالمان (kalman averaging)، وذلك لإجراء مقارنات كمية لنشاط CRE في المقطع C حيث تظهر الفلورة بأعلى كثافة.

انتقل إلى جدول بحث تحذير التشبع واضبط كسب جهد القناة والإزاحة إلى إعدادات تؤدي إلى تشبع عدد قليل من البكسلات. إذا لزم الأمر، اضبط فتحة المجهر البؤري. بمجرد تحديد الإعدادات المثلى، قم بتشغيل مسح ZS للحصول على سلسلة من الصور على طول المحور Z.

عند اكتمال عملية المسح، قم بتحويل مجموعة الصور المتراكمة إلى صورة إسقاطية واحفظ ملف الصورة هذا بصيغة TIF. ولإجراء مقارنة كمية لأنشطة CRE، استخدم نفس إعدادات المجهر البؤري لجميع العينات المكررة وخطوط الجينات المراسلة. وبالنسبة للتجربة باستخدام برنامج Image J، ابدأ بفتح صورة TIFF المراد تقييمها.

انقر على زر التحديد الحر (freehand selection) وقم بتحديد منطقة العينة المراد إجراء التحديد الكمي لها. وللحصول على إحصائيات قيمة البكسل، انقر على علامة تبويب التحليل (analyze) ثم اختر القياس (measure). سجل درجة متوسط قيمة البكسل من صندوق النتائج.

قم أيضاً بجمع قيمة بكسل متوسطة ثانية من منطقة خلفية لا يكون فيها عنصر الاستجابة المركب (CRE) نشطاً. وللاشتقاق قيمة بكسل متوسطة معدلة، استمر في إنشاء إحصائيات قيم البكسل للعينات المكررة. ثم من قيم البكسل المتوسطة المعدلة المكررة، حدد متوسط النشاط التنظيمي لـ A CRE واحسب أيضاً الخطأ المعياري للمتوسط.

تستخدم هذه التجربة شدة النمط الظاهري لعين الإنقاذ البيضاء لجعل السلالات المعدلة وراثياً متماثلة الزيجوت. ويتم استخدام خلفية جينية طافرة لجين white مع تسلسل موقع هبوط A TTP لدمج الجين المنقول في موقع محدد. ويتم التمييز بين الأفراد المعدلين وراثياً، سواء كانوا متغايري الزيجوت أو متماثلي الزيجوت للناقل المدمج، من خلال شدة لون العين التي تم إنقاذها بناءً على عدد نسخ جين mini white المدمج.

يتم بعد ذلك إنشاء سلالات متماثلة الزيجوت عن طريق تزاوج الذباب الذكري والأنثوي الذي يظهر النمط الظاهري للون العين الأكثر قتامة. تُستخدم العلامات المورفولوجية لتحديد مرحلة التحول لذبابة الدروسوفيلا أثناء عملية التحول من يرقة إلى ذبابة فاكهة بالغة. يمر العينة بسلسلة من المورفولوجيات النمطية التي يمكن استخدامها لتحديد الجنس وتقدير المرحلة التطورية هنا.

تعمل نسخة من النوع البري لعنصر تنظيم الاستجابة (CRE)، والمشار إليها بالعنصر ثنائي الشكل، على تحفيز مستويات عالية من تعبير المراسل EGFP في القطعة البطنية ASIC لإناث ذبابة puy. وقد وُجد أن تسلسلاً مكوناً من 13 زوجاً قاعدياً ضمن عنصر تنظيم الاستجابة هذا يمثل موقع ارتباط لعامل النسخ DSX، ويتم إثبات الأهمية الحيوية لهذا التسلسل في الجسم الحي من خلال قياس النشاط التنظيمي لعنصر تنظيم الاستجابة عند حدوث طفرة في موقع الارتباط هذا. وتشير التحليلات الكمية إلى أن طفرة موقع DSX هذه خفضت النشاط التنظيمي إلى 28 ± 3% من التعبير الخاص بالنوع البري في سياق موقع إدراج الجين المنقول المستخدم هنا.

تقيّم مقارنات مماثلة الأنشطة التنظيمية لأليلات CRE داخل النوع الواحد أو بين عناصر CRE ذاتية من أنواع مختلفة، على سبيل المثال، مقارنة بمستويات EGFP في القطعة الأنثوية. تمتلك عناصر CRE ذاتية لأنواع D stimulants و D willi، والتي تم تحفيزها بواسطة سلالة D Melin gastric Canin S، أنشطة تنظيمية تعادل 75 ± 4% و 0 ± 0% على التوالي. يمكن استخدام طرق إجرائية تالية مثل تداخل RNA مع جينات عوامل النسخ للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية تفاعل جينات عوامل النسخ هذه مع العناصر التنظيمية لـ CYS.

يُستدل على ذلك من خلال زيادة ونقصان تعبير البروتين المراسل الفلوري الذي يتم توجيهه بواسطة العناصر التنظيمية cis بعد تطوره. وقد مهد هذا الإجراء الطريق للباحثين في مجال تنظيم الجينات لاستكشاف الأهمية الوظيفية التي تفرضها زخارف العناصر التنظيمية cis والطفرات المتطورة على التعبير الجيني.