رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

في هذا الفيديو، يتم رصد أنشطة الكيناز والفوسفاتاز طوال الدورة الخلوية باستخدام نقل طاقة الرنين لفورستر أو fret. هنا، يحتوي مسبار نشاط الكيناز الشبيه بـ polo 1 أو LK one على بروتين فلوري سماوي CFP في أحد طرفيه وبروتين فلوري أصفر YFP في الطرف الآخر. يتم نقل هذا المسبار بالتر transfection إلى خلايا U2 OS.

بعد ذلك، ومن أجل فحص حالة فسفرة أهداف LK one خلال الانتقال من طور G2 إلى طور M، تخضع خلايا U2 OS التي تم إجراء عملية التعداء (transfected) لها إلى تصوير فلوري بفاصل زمني. عندما يكون CFP وYFP في تقارب وثيق ويتم استثارة CFP، تنتقل الطاقة إلى YFP ويمكن حينئذٍ اكتشاف انبعاث YFP. ومع ذلك، عندما يتم فسفرة المسبار، يؤدي التغير التشكيلي في البروتين إلى فصل CFP عن YFP.

الآن عند استثارة CFP، يتم الكشف عن انبعاث قوي لـ CFP وانبعاث ضعيف فقط لـ YFP؛ ويظهر قياس نسبة انبعاث YFP بعد استثارة كل من CFP وYFP أن نشاط PLK one يزداد في مرحلة G two ويصل إلى ذروته أثناء الانقسام الفتيلى. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التصوير الهندسي القياسي، هي التركيز بشكل خاص على عدم اضطراب الدورة الخلوية سواء بسبب ظروف التصوير أو بسبب التعبير عن المسبار. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الدورة الخلوية، مثل مكان وزمان تنشيط كينازات أو فوسفاتازات محددة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول الإنزيمات التي تنظم الدورة الخلوية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى تتطلب ظروفاً غير مفرزة، مثل مقايسات تكاثر الخلايا. ولمراقبة الدورة الخلوية البشرية، يتم ترانسفكشن خلايا U2 OS بمسبار نشاط PK one يعتمد على تقنية FRET. وباستخدام طريقة ترانسفكشن قياسية بفوسفات الكالسيوم، يتم اختيار الخلايا في pur mycin لمدة سبعة أيام على الأقل.

يعمل هذا الإجراء على إثراء مجموعة الخلايا التي تعبر عن المسبار، ويحد من عدد الخلايا ذات مستويات التعبير السامة أو مستويات التعبير التي تؤثر بشدة على الدورة الخلوية. بعد ذلك، يتم اختيار المستعمرات المستقرة عن طريق التخفيف المحدود، ويُفحص التعبير عن CFP وYFP للتأكد من وجودهما في جميع الخلايا وبنفس النسبة تقريباً. وإذا كانت بعض الخلايا تحتوي على CFP أو YFP فقط، فمن المرجح أن يكون قد حدثت عملية إعادة تركيب؛ وفي هذه الحالة، كرر تحضير البلازميد باستخدام بكتيريا أقل عرضة لإعادة التركيب المتماثل، مثل خلايا sure 2، ثم قم بخصخصة البلازميد (linearize) وأعد عملية عفن الخلايا (transfection).

بمجرد أن تعبر الخلايا عن المسبار بشكل مستقر، يتم استزراعها في أطباق ذات قاع زجاجي برقم 1.5 بعد أن تلتصق وتصل نسبة تلاقيها إلى 30 إلى 50%. استبدل الوسط بوسط مستقل عن CO2 ولا يحتوي على الفينول الأحمر، ثم ثبت الخلايا على مجهر فلوريسنس فوقي (epi fluorescence microscope) بمحرك مع ضبط التحكم في درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. يجب أن يكون المجهر مجهزاً بمرشحات إثارة وانبعاث لبروتيني CFP وYFP.

مرآة ROIC مناسبة لمراقبة CFP و YFP وعدسة شيئية مناسبة للدقة المطلوبة. في هذه الحالة، تم استخدام عدسة شيئية هوائية 20 x NA 0.75. باستخدام الضوء النافذ، يتم ضبط تركيز الخلايا.

تجنب استخدام الضوء الفلوري في هذه المرحلة لأن ذلك سيحفز استجابة إجهاد قد تؤدي إلى اضطراب في الدورة الخلية. ولتجنب السمية الضوئية، اضبط درجة الانحناء على أقصى قيمة متاحة تسمح بالدقة المطلوبة على المستوى دون الخلوي. بالنسبة لهذه التجربة، يجب أن يكون من الممكن التمييز بين النواة والسيتوبلازم.

اضبط زمن تعريض قصيراً وأدخل مرشح كثافة محايدة عالية. بعد ذلك، قم بالتقاط صورة اختبار بدقة 12 أو 16 بت باستخدام استثارة وانبعاث YFP، ثم اضبط زمن التعريض ومرشحات الكثافة المحايدة بحيث تكون متوسط الكثافة في الخلية مساوياً تقريباً لكثافة الخلفية مضافاً إليها خمسة أضعاف الفرق بين أدنى وأقصى كثافة للخلفية. وللتحقق من عدم وصول الصور إلى مرحلة التشبع، افحص كثافة الفلورة لصورة العينة.

يجب أن تكون الشدة القصوى في الصورة أقل من نصف النطاق الديناميكي للسماح بوجود اختلافات في الشدة عندما تدخل الخلايا في مرحلة الانقسام الفتيلي. بعد ذلك، كرر هذه العملية باستخدام مرشحات إثارة CFP ومرشحات انبعاث YFP. حدد مناطق متعددة تحتوي على خلايا محولة جينياً، مع استبعاد المناطق التي استُخدمت لضبط التركيز وتحسين ظروف التعريض الضوئي.

بما أن هذه الإجراءات قد تكون أدت إلى استجابة إجهاد، تأكد من أن الكثافة القصوى أقل من نصف النطاق الديناميكي في جميع الخلايا. قم بتوجيه البرنامج لالتقاط صورتين كل 45 دقيقة باستخدام استثارة YFP، وانبعاث YFP واستثارة CFP. مرشحات انبعاث YFP.

قم أيضاً بضبط الطول الإجمالي للتجربة ليتجاوز مدة الدورة الخلوية. بمجرد ضبط كل شيء، ابدأ في التقاط الصور، وبعد اكتمال عملية الالتقاط، افتح الصور المكتسبة وراقب وقت الدورة الخلوية من الانقسام الفتيل إلى الانقسام الفتيل التالي. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن المسبار المنقول هنا، كان وقت الدورة الخلوية يتراوح تقريباً بين 20 إلى 25 ساعة.

قارن هذه النتائج بالبيانات الضابطة لنوع الخلايا المستخدم. إذا كان وقت الدورة الخلوية يتوافق مع التوقيتات المرجعية، يمكن تحليل الـ fret. وبمجرد التحقق من التوقيت، يمكن تحليل الصور.

يمكن إجراء التحليل بواسطة معظم البرامج المخصصة للمجهرية. وفي هذه التجربة، تم استخدام البرنامج المجاني Image J مع إضافة ratio plus. ابدأ التحليل بفتح الصور في برنامج Image J. وإذا كانت الصور بتنسيق مكدس متعدد الألوان، فقم بفصل القنوات الفردية عن طريق تحويلها إلى hyper stack من خلال تحديد الصورة.

بعد ذلك، اختر hyper stack ثم stack to hyper stack. ستفتح نافذة convert to hyper stack مع ظهور الإعدادات المعروضة، انقر موافق. ستظهر الصورة الآن مع وجود شريطي تمرير أسفلها.

لتقسيم الصور إلى مجموعات ذات قناة واحدة، انقر فوق الصورة واختر hyper stack reduce dimensionality. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة reduce، تأكد من تحديد frames وkeep source، ثم انقر فوق Okay.

ستظهر صورة جديدة تحتوي على قناة واحدة فقط. كرر هذه العملية لإظهار صورة جديدة بالقناة الثانية. بعد ذلك، ولزيادة الوضوح البصري للصور النهائية، اختر YFP excitation YFP emission stack.

انقر فوق "process"، ثم انقر فوق "math". بعد ذلك، اختر "multiply". عندما تفتح نافذة "multiply"، أدخل القيمة ثلاثة لضرب مكدس إثارة YFP وانبعاث YFP في ثلاثة. هذه الخطوة اختيارية وتضمن ألا تكون النسب في النطاق ما بين صفر وواحد.

بعد ذلك، من شريط أدوات ImageJ، اختر أداة الرسم الحر (freehand tool). ثم في مكدس إثارة YFP وانبعاث YFP، ارسم منطقة اهتمام (ROI) في منطقة خالية من الخلايا، ولكنها قريبة من خلية سيتم قياسها؛ ولإضافة منطقة الاهتمام إلى مدير مناطق الاهتمام (ROI manager)، انقر على أدوات التحليل (analyze tools)، ثم مدير مناطق الاهتمام (ROI manager).

ستظهر نافذة مدير منطقة الاهتمام (ROI manager). انقر على add لحفظ إحداثيات منطقة الاهتمام لقياس متوسط الشدة لمنطقة الاهتمام في مكدس استثارة YFP وانبعاث YFP. انقر على analyze، ثم اختر measure.

ستفتح نافذة النتائج. حدد مجموعة صور إثارة CFP وانبعاث YFP. ثم انقر نقراً مزدوجاً على منطقة الاهتمام (ROI) في مدير مناطق الاهتمام (ROI manager) وأعد عملية القياس.

تتم إضافة القياس إلى نافذة النتائج. قم بالتمرير إلى مواضع أخرى في المكدس لتكرار هذه العملية عند نقاط زمنية متعددة. تحقق من أن شدة الخلفية القريبة من الخلية المستهدفة متشابهة في جميع أنحاء الفيلم من خلال مقارنة القياسات في نافذة النتائج.

لضبط القياسات بحيث تشمل الحد الأدنى من الكثافة، انقر فوق analyze، ثم انقر فوق set measurements وحدد القيمة الرمادية الدنيا والقصوى. ستظهر نافذة تعرض بدائل القياس بعد ذلك. بعد ضبط السطوع والتباين حسب الضرورة، ارسم منطقة اهتمام (ROI) تغطي معظم الخلية وقم بقياس الحد الأدنى من الكثافة في كلتا المجموعتين (stacks).

ثم قم بأخذ القياسات كما سبق، ولكن باستخدام خلية هذه المرة بدلاً من الخلفية. وباستخدام القيم الواردة في أقسام النتائج، احسب الفرق بين أقل شدة مقاسة وشدة الخلفية ثم اقسم الناتج على اثنين. يوفر هذا تقديراً أولياً لقيمة القص (clipping value) بالنسبة لنسبة الفتح في بعض الملحقات الإضافية المختارة.

بعد ذلك، اختر ratio plus. ثم بالنسبة لنسبة FRET، حدد CFP excitation YFP emission S stack one، أو بالنسبة لنسبة FRET المعكوسة لتصور المجسات التي تنخفض فيها كفاءة FRET عند الفسفرة، حدد YFP excitation YFP emission S stack one لإدراج قيم شدة الخلفية المقاسة وقيم القص (clipping values).

استخدم القيم من نافذة النتائج والصقها في نافذة ratio plus. حدد مقياس التدرج لمجموعة الصور الناتجة (ratio stack) وطبق جدول بحث (lookup table) مناسب لتصور التغيرات في النسبة. تم تصوير خلايا U2 OS التي تعبر عن مسبار يعتمد على تقنية FRET لمراقبة نشاط PLK1 لمدة 60 ساعة كما هو موضح في هذا الفيديو.

تظهر هذه الصورة الدخول التراكمي في الانقسام الفتيل لـ 50 خلية تعبر عن مسبار fret، بما في ذلك انقسامات الخلايا الوليدة. تتكاثر غالبية الخلايا التي تعبر عن المسبار بزمن دورة خلية يتراوح بين 20 و 25 ساعة، مما يشير إلى أن ظروف التصوير ومستويات تعبير المسبار لا تؤثر على توقيت دورة الخلية. ويوضح تمثيل بالألوان الزائفة لنسبة fret المعكوسة، من خلال تتبع خلية واحدة عبر أربعة انقسامات، أنه على الرغم من وجود ضوضاء ملحوظة، إلا أنه يُلاحظ وجود اتجاه تزداد فيه نشاط PK one في طور G two ويصل إلى ذروته أثناء الانقسام الفتيل.

عندما يتم ترشيح البيانات الخام باستخدام مرشح المتوسط وعرضها في شكل رسم بياني، يسهل تقدير الوقت بين ذروات النشاط. يوضح هذا الشكل كمية نسبة FRET المعكوسة للخلية الموضحة في الصور السابقة من الرسم البياني. يمكن تقدير توقيت التنشيط، وكما يتضح هنا، تصبح فسفرة المسبار مرئية قبل حوالي أربع ساعات من وصول الفسفرة إلى ذروتها في الانقسام الفتيلي.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على الخلايا في حالة خالية من الإجهاد، ويتم ذلك عن طريق تقليل التعرض للضوء بالإضافة إلى تقليل التغيرات في درجة الحرارة أو pH. ومن المهم أيضاً تذكر أن هذه الطريقة تراقب التوازن بين نشاط الكيناز والفسفاتاز في الخلية. يمكن دمج هذا الإجراء مع تداخل RNA أو فحوصات المثبطات لتحديد المنظمات العلوية لهذه الكينازات والفسفاتازات.