طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

مرحباً، أنا جيرسي. وأنا اسمي شابي، ونحن كلاهما باحثان في مرحلة ما بعد الدكتوراه في إمبريال كوليدج لندن، ونعمل مع البروفيسور أندرو دي ميلو والدكتور جوش ديل في منصات قطيرات الموائع الدقيقة. تُعد منصات الموائع الدقيقة القائمة على القطيرات مرشحة واعدة لإجراء تجارب ذات إنتاجية أعلى، وذلك لإمكانية توليدها بأحجام دقيقة ومحددة للغاية، كما يمكن أن يصل تردد توليدها إلى عدة kilo pers.

علاوة على ذلك، بما أنه يمكن تغليف المنطقة محل الاهتمام في مقصورات يصل حجمها إلى بضعة لترات، فإنه يمكن القضاء على كل من التداخل والتشتت، كما يمكن توقيت العمليات التحليلية بدقة أكبر. وقد نجحنا في مجموعتنا البحثية بالفعل في تطبيق منصات القطرات الدقيقة في العديد من التطبيقات؛ على سبيل المثال، تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتخليق الجسيمات النانوية، ومقايسة الخلية الجزيئية المفردة.

يجب استخلاص الكميات الكبيرة من المعلومات التي يتم إنتاجها ضمن هذه الأنظمة وتسخيرها والاستفادة منها بكفاءة. وفي هذا الصدد، يجب أن تكون طريقة الكشف المختارة مناسبة، وتوفر حساسية عالية وحدود كشف منخفضة، وتكون قابلة للتطبيق على مجموعة من الأنواع الجزيئية، وغير مدمرة، وقابلة للتكامل مع الأجهزة الموائعية الدقيقة بطريقة سهلة. وتلبية لهذه الحاجة، قمنا بتطوير مجموعة من الأدوات والبروتوكولات التجريبية التي تمكن من استخلاص كميات كبيرة من المعلومات الفيزيائية من بيئات ذات أحجام صغيرة، وهي قابلة للتطبيق في تحليل مجموعة واسعة من العوامل الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية.

في هذا البروتوكول، سنعرض طريقتين يتم تطبيقهما للكشف عن الخلايا المفردة ورسم خرائط عمليات الخلط في Dropbox. تُصنع الرقاقات الموائعية الدقيقة تقليديًا من poly dimethyl siloxane (PDMS) باستخدام طرق التصوير الضوئي. يجب تنفيذ هذه العملية في منشأة غرفة نظيفة للحصول على قنوات موائعية دقيقة؛ حيث يتم طلاء SU-8 50 على رقاقة سيليكون، ثم تُجرى عملية الخبز اللين (soft bake) على لوح ساخن عند 65 درجة و95 درجة لتبخير المذيب وتكثيف الغشاء، وبعد التبريد، يتم تعريض مقاوم SU-8 للأشعة فوق البنفسجية (UV) تحت القناع المناسب، ثم تُخبز الرقاقة عند 65 درجة و95 درجة بعد التبريد.

قم بتظهير المناطق غير المعرضة للضوء باستخدام محلول التظهير المناسب مع التحريك. استخدم مذيب EC جديد لشطف الرقاقة ثم جففها بتيار غازي لإنشاء سطح نظيف. عالج الرقاقة بعمليات غسل باستخدام الهكسان والميثانول.

ولإكمال عملية تصنيع القالب الرئيسي، يتم تبخير عامل تثبيت على السطح في مجفف لمدة 40 دقيقة. ولتكوين ركائز مائعية دقيقة مهيكلة، نقوم بخلط S guard 1 8 4 بنسبة 10 إلى 1 من الراتنج إلى الرابط التشابكي، ثم نسكب هذا المزيج فوق القالب الرئيسي. يتم تفريغ الهواء من هذا المزيج في مجفف، ثم يتم معالجة الجهاز عند 65 درجة.

قم بقص مادة PDMS المعالجة وفصلها عن القالب الرئيسي. قم بعمل فتحات وصول للأنابيب المائعية باستخدام خرامة خزعة. قم بمعالجة طبقة أخرى من PDMS لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة.

ضع الطبقة العلوية المُجهزة فوق الطبقة السفلية واتركها لتتصلب طوال الليل عند 65 درجة. انزع الرقاقات من طبق بتري وقم بتقطيعها. وبمجرد تصنيع الرقاقات، تصبح جاهزة للاستخدام عن طريق حقن المحاليل المطلوبة.

املأ المحاقن بالمحاليل المطلوبة، مع التأكد من عدم بقاء أي فقاعات هوائية في أي جزء من الأنابيب. ولتوليد القطيرات، يتم استخدام طورين؛ حيث يحتوي الطور المائي المشتت على الكواشف المعنية.

تعمل المرحلة الزيتية كمرحلة مستمرة؛ قم بتركيب أنابيب ذات قطر داخلي مماثل لقطر رؤوس إبر المحاقن في أحد الأطراف على الإبر، ثم ثبت المحاقن على مضخة محاقن وحدد معدل التدفق المطلوب للحقن. وبالنسبة لكل مرحلة، يُوصى بأن تكون النسبة الدنيا لمعدلات تدفق الزيت إلى الوسط المائي هي 1 لتجنب ترطيب الـ PDMS بواسطة المرحلة المائية، مما قد يؤدي إلى تكوين قطرات غير مستقرة. قم بتوصيل الأطراف الأخرى للأنابيب مباشرة بالثقوب الموجودة في ركيزة الـ PDMS.

بالنسبة للمحاليل الأكثر تعقيداً، يمكن أيضاً استخدام السيليكا، أو المنافذ الشعيرية، أو الموصلات. قم بتوصيل منفذ المخرج في الشريحة بالأنبوب وتوجيهه إلى وعاء تجميع لجمع النفايات أو لإجراء عمليات تحليل إضافية. بمجرد إتمام هذا الإعداد، يوجد تكوينان رئيسيان للقنوات الدقيقة لتوليد القطيرات: تركيز التدفق أو تنسيق الوصلة على شكل T، وذلك نتيجة لقوى القص التي تنشأ من استخدام هذه الأشكال الهندسية لدمج السائلين المسموح بهما، وما يلي ذلك من عدم استقرار شعيري يتطور عند الواجهة البينية.

يتم توليد قطرات متفرقة صغيرة جداً يصل حجمها إلى بضع femtoliters بشكل تلقائي. وبمجرد توليد هذه القطرات، يمكن فحصها باستخدام تجهيزات بصرية. وقد تم إعداد النظام البصري وفقاً للبروتوكول التالي.

استخدم مجهرًا بؤريًا (confocal microscope) يتميز بقدرة آلية على تحديد المواضع بدقة أقل من الميكرون، وليزر يعمل بطول موجي يتوافق مع امتصاص الأصباغ الفلورية المستخدمة. ولإثارتها، استخدم ليزرًا نبضيًا يعمل بمعدلات تكرار تصل إلى عدة ميجاهرتز للتصوير المعتمد على العمر الزمني للفلورة. وتستخدم تجارب البلغم مرايا توجيه الحزمة وبصريات للتحكم في ارتفاع الحزمة وكذلك اتجاهها.

استخدم مرآة ثنائية اللون لعكس شعاع الليزر نحو العدسة الشيئية. وفي حال استخدام ليزرين في آن واحد، يمكن تركيب مرآة ثنائية اللون ذات نطاق مزدوج. وللسماح بانعكاس شعاعي الليزر، استخدم عدسة شيئية مجهرية ذات فتحة عددية NA عالية ومصححة للانهاية لتركيز ضوء الليزر بدقة عالية داخل قناة مائعية دقيقة.

قم بتجميع الفلورة المنبعثة من العينة داخل القناة الموائع دقيقة، باستخدام نفس الشيئية ذات الفتحة العددية (NA) العالية والمرسلة عبر نفس المرآة ثنائية اللون. قم بإزالة أي ضوء استثارة متبقٍ باستخدام مرشح انبعاث أحادي أو ثنائي النطاق. قم بتركيز انبعاث الفلورة على ثقب صغير بقطر 75 micrometer.

باستخدام عدسة محدبة مستوية، قم بوضع الثقب في المستوى البؤري المشترك لعدسة المجهر الشيئية. استخدم مرآة ثنائية اللون أخرى لتقسيم الإشارة الفلورية على كاشفين.

قم بترشيح الفلورة المنعكسة بواسطة المرآة ثنائية اللون باستخدام مرشح انبعاث، ثم ركزها باستخدام عدسة محدبة مستوية على الكاشف الأول. بالنسبة للتجارب التي تتضمن فلوراً أحمر ثانوياً، قم بترشيح الفلورة النافذة عبر المرآة ثنائية اللون باستخدام مرشح انبعاث آخر، ثم ركزها باستخدام عدسة محدبة مستوية أخرى على الكاشف الثاني. استخدم الثنائيات الضوئية الانهيارية للكشف عن فوتونات الفلورة.

من أجل الحصول على بيانات الفلورة، قم بربط الإشارة الإلكترونية الصادرة من كاشف الصمام الثنائي الضوئي الانهياري (avalanche photo diode) بجهاز الحصول على البيانات (DAQ) متعدد الوظائف لتسجيل البيانات عبر جهاز كمبيوتر شخصي. أما بالنسبة لتجارب البلغم، فاستخدم ليزر نبضي وقم بتوصيل الكاشفات ببطاقة TCS لعد الفوتونات المنفردة المرتبطة زمنياً والمثبتة على جهاز كمبيوتر منفصل. تتيح هذه البطاقة الحصول على بيانات عمر الفلورة.

باستخدام منهجية TCS PC، يتم ربط كل فوتون فلوري مكتشف بنبضة ليزر ساقطة، وبالتالي يتم تعيين وقت تأخير لكل فوتون فلوري منبعث. ويمكن ملاءمة هذه البيانات مع منحنى اضمحلال أسي أحادي أو متعدد للحصول على تقدير لمعدل الإشعاع للفلوروفورات.

نعلم الآن أن الخلايا غير متجانسة للغاية من منظور بيولوجي وفيزيائي وكيميائي. لذا، من الناحية المثالية، ينبغي لنا تحليل كل خلية على حدة. ومع ذلك، يجب إجراء الاختبارات بإنتاجية عالية حتى نتمكن من جمع معلومات كمية كافية للوصول إلى استنتاج موثوق وذي دلالة.

لدينا هنا مثال على تغليف خلايا E. coli في قطرة واحدة، وذلك لتوضيح كيفية تنفيذ هذه العملية. استخدم سلالة E. coli TOP10 التي تم استزراعها طوال الليل. ومن أجل الكشف عن حيوية الخلايا، استخدم صبغتي Cyto 9 وpropidium iodide.

كلا الصبغتين هما من صبغات تداخل الحمض النووي (DNA intercalating dyes)، وتزداد شدة فلورستهما بأكثر من 20 ضعفاً. عند الارتباط بالـ DNA، تكون صبغة cyto nine صبغة فلورية خضراء نفاذة للغشاء، بينما تكون صبغة propidium iodide صبغة فلورية حمراء غير نفاذة للغشاء.

وبالتالي، تُظهر الخلايا الحية فلورة خضراء، بينما تُظهر الخلايا الميتة انبعاثات خضراء وحمراء معاً. يمكننا هنا رؤية عملية توليد القطيرات وتغليف خلية واحدة باستخدام وصلة T. تم تسجيل هذا الفيديو باستخدام كاميرا عالية السرعة، ولكن يمكن توليد القطيرات بمعدل آلاف القطيرات في الثانية.

عند تغليف الخلايا، يجب التأكد من تخفيف مزرعة الخلايا بحيث يكون عدد الخلايا أقل من عدد القطيرات المتولدة، ومنع الخلايا من الترسيب، وهو أمر قد يحدث داخل المحقنة أو الأنابيب. استخدم قضيب تحريك مغناطيسي داخل المحقنة للحفاظ على توزيع الخلايا بشكل متجانس في المحلول. استخدم أنابيب رقيقة جداً، 50 micrometers لتوصيل المحقنة بالشريحة الدقيقة.

يضمن ذلك معدل تدفق سريع داخل الأنابيب، وبالتالي يمنع ترسيب الخلايا. فيما يلي أمثلة نموذجية لتعداد الفوتونات كدالة في الزمن للتجارب القائمة على الخلايا. لرسم خريطة لعمليات الخلط داخل القطيرات.

يمكن توليد القطيرات باستخدام صبغتين فلوريتين مختلفتين بأعمار نصف مختلفة. ويتم توليد مجال تدفق داخل القطيرة المتدفقة، مما يؤدي في النهاية إلى خلط المحلولين اللذين كانا منفصلين في الأصل لتعزيز عملية الخلط. كما يمكن تعديل تماثل مجال التدفق باستخدام قنوات متعرجة.

من أجل سبر القطيرات، قم بتركيز حجم المسبار البصري عند نصف ارتفاع قناة دقيقة تتدفق عبرها القطيرات، بدءاً من أحد جانبي القناة، وأجرِ كل تجربة على طول عرض القناة بالكامل بفاصل قدره one micrometer. قم بتنفيذ خوارزمية لتمييز الومضات الفردية المرتبطة بالقطيرات عن ضوضاء الخلفية للطور الزيتي، وتحديد مدة كل ومضة.

قم بتنفيذ خوارزمية ثانية لاستخراج قيم زمن التأخير والشدة على طول كل قطرة عند العرض المحدد الذي أجريت عنده التجربة. ثم استخدم خوارزمية تقدير الاحتمال الأقصى MLE لتقييم عمر الفلورة لكل قطرة في التجربة. إن حساب متوسط قيم العمر لجميع القطرات في التجربة يقلل من الخطأ النهائي لحساب MLE.

كلما زاد عدد القطرات التي يتم فحصها، قلّ الخطأ بمجرد الحصول على مسار لعمر النصف. وبالنسبة لكل عرض، يتم دمج جميع المسارات في خريطة ثنائية الأبعاد (2D map). وبما أن كل قيمة لعمر النصف ترتبط بخليط معين من الفلوروفورين، فمن الممكن بالتالي الحصول على خريطة للتركيز أو الخلط.

لقد وصفنا عملية تصنيع جهاز دقيق وإعداداً تجريبياً والبروتوكولات المرتبطة بهما لتكوين القطيرات الدقيقة وتغليف المناطق والكشف البصري عن العملية والقطيرات. وقد تناول المثالان المختاران الكشف عن الخلايا المفردة داخل القطيرات ورسم خرائط لعمليات الخلط. تمثل هذه الحالات تطبيقات شائعة داخل القطيرات المتدفقة ويجري البحث فيها حالياً باستخدام ميكروفلويديكا القطيرات.

كما توضح التجارب المعروضة، فإن استخدام منصات الموائع الدقيقة القائمة على القطيرات يتميز بخصائص جذابة معينة مثل الإنتاجية العالية الناتجة عن الحصر التام وقابلية التكرار الأعلى. وبسبب الكم الهائل من المعلومات الناتجة والسرعة الفائقة التي يتم بها توليد هذه المعلومات، يتطلب الأمر استخدام طرق كشف سريعة ذات دقة مكانية وزمانية قصوى لتحقيق الاستفادة الكاملة من هذه المنصات المصغرة.

في هذه الحالة، نوضح أن هذا الأمر ممكن باستخدام تقنيات التحليل الطيفي الفلورية عالية الدقة.