المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة تأثير الحمل الميكانيكي على التحلل البروتيني لبروتينات مفردة بطريقة عالية التوازي وفعالة من حيث التكلفة. في هذا العرض التوضيحي، يتم فحص تحلل الكولاجين بواسطة إنزيم matrix metalloproteinase one؛ حيث يتم في الخطوة الأولى تثبيت مقلمات الكولاجين على الغطاء الزجاجي لخلية تدفق، يليه تثبيت حبيبات مغناطيسية بحجم الميكرومتر بجزيئات الكولاجين الفردية. وتتمثل الخطوة الثانية في تركيب خلية التدفق في جهاز الملاقط المغناطيسية والتحقق من إزالة الحبيبات المرتبطة بشكل غير محدد من سطح الغطاء الزجاجي.

بعد ذلك، يُضاف البروتياز إلى خلايا التدفق. وتتمثل الخطوة النهائية في تحديد معدل التحلل البروتيني من خلال مراقبة انفصال الخرزات في الوقت الفعلي. ومن خلال قياس معدلات انفصال الخرزات عند تركيزات وقوى مختلفة من البروتياز، يمكن اشتقاق المعلمات الحركية الحيوانية القياسية باستخدام كميات ضئيلة من الركيزة والبروتياز.

بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه التقنية معلومات فريدة حول تأثير القوة الميكانيكية على معدل التحلل البروتيني وعلى التغيرات الهيكلية في البروتين الركيزة التي تصاحب عملية الانشطار. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى مثل تتبع القوة البصرية (optical T traces) ومجهر القوة الذرية، في أنها ذات إنتاجية عالية وفعالة من حيث التكلفة. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول القوة المؤثرة على الانشطار البروتيني للبروتينات المنفردة، إلا أنه يمكن تطبيق الأجهزة والتقنيات المستخدمة على نطاق واسع من المشكلات الفيزياء الحيوية، بما في ذلك تأثير القوة على طي البروتين وتشكيله.

ابدأ بتجهيز خلية التدفق عن طريق تنظيف شرائح الغطاء باستخدام جهاز سونيكاشن. ضع شرائح الغطاء في وعاء زجاجي صغير يتسع لها ويمكن وضعه في جهاز السونيكاشن. املأ الوعاء بـ isopropanol وعالجه بالسونيكاشن في حمام مائي لمدة 20 دقيقة، ثم تخلص من isopropanol واشطف شرائح الغطاء بكميات وفيرة من الماء منزوع الأيونات.

املأ الوعاء بالماء واستخدم جهاز السونيكيشن لمدة 20 دقيقة. بعد السونيكيشن، جفف شرائح التغطية بتيار من الهواء المفلتر والخالي من الغبار. افحص شرائح التغطية واستخدم فقط تلك الخالية من اللطخات.

قم بتعقيم شرائح التغطية باللهب بلطف لبضع ثوانٍ لتنظيفها من أي غبار أو رطوبة متبقية عن طريق تمرير شرائح التغطية عبر لهب غازي ناتج عن موقد بنزن، مع الحرص على عدم تقويس شريحة التغطية بسبب الحرارة الزائدة. تعمل هذه الخطوة على إزالة الملوثات السطحية المتبقية.

بعد ذلك، استخدم شريطاً لاصقاً مزدوج الوجه لربط شريحتين غطائيتين معاً. قم أولاً بقص الشريط بطول 3 سنتيمتر تقريباً وعرض 0.3 سنتيمتر، ثم ألصقه على شريحة غطائية بمقاس 22 × 40 مليمتر، مع ترك قناة بطول 1.6 سنتيمتر في المنتصف. استخدم طرف ماصة للضغط برفق على الشريحة الغطائية لضمان التصاق الشريط بشكل صحيح.

تم بناء جهاز الملاقط المغناطيسية في هذا المختبر باستخدام دعامة ألمنيوم على شكل حرف L تحتوي على ثقب قطره 1 mm، وثُبتت على مترجم Z رأسي لضبط ارتفاع الملاقط. تم تثبيت مغناطيسين دائمين من العناصر الأرضية النادرة على الدعامة على جانبي الثقب لإنشاء تدرج في المجال المغناطيسي. ويعد المعايرة الصحيحة للمصيدة المغناطيسية أمراً ضرورياً لهذا الإجراء.

لضمان النجاح، نستخدم طريقتين مختلفتين كما هو موضح في هذا القسم. لمعايرة المصيدة المغناطيسية، استخدم حمض DNA مُعد مسبقاً من Lambda phage وموسوماً عند نهايتيه 5' و 3' بالبيوتين والدوجي-أوكسجين كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ولربط الـ DNA بخلية التدفق، املأ خلية التدفق أولاً بمحلول مضاد الدوجي-أوكسجين والأجسام المضادة، واترك الأجسام المضادة تلتصق بالسطح الزجاجي لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، قم بمعالجة سطح خلية التدفق لمنع الالتصاق غير النوعي للحمض النووي DNA عن طريق إضافة محلول BSA إلى خلية التدفق. لاحظ أنه في خطوة المعالجة هذه وجميع الخطوات اللاحقة، يجب أن يكون حجم الكاشف المضاف إلى خلية التدفق ضعف الحجم على الأقل. وبما أن حجم خلية التدفق في هذا العرض التوضيحي هو 75 microliters، فقم بحضن خلية التدفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 minutes.

بعد تكرار هذه الخطوة، أضف 50 pico molar من DNA lambda الوظيفي واتركه ليلتصق بالشريحة الزجاجية لمدة 15 دقيقة، ثم اغسل DNA الزائد باستخدام XPBS واحد. وأخيراً، أضف حبيبات فائقة المغناطيسية مغلفة بالستريبتاديفين واتركها لتلتصق بالـ DNA المثبت لمدة 15 دقيقة. في هذا العرض التوضيحي، تُستخدم حبيبات بحجم 2.8 micrometer.

اغسل الخرز الزائد باستخدام محلول XPBS واحد. بعد ذلك، قم بمعايرة الملاقط المغناطيسية عن طريق تحريك المغناطيسات الدائمة إلى موضع بعيد عن سطح العينة. ثم ضع خلية التدفق المُجهزة في المجهر.

قم بتحريك المغناطيسات الدائمة إلى موضعها فوق خلية التدفق. اختر المستوى البؤري لحبيبات Lambda DNA الوظيفية من خلال التركيز على الحبيبات بعيداً عن كلا السطحين الزجاجيين. المستوى البؤري الصحيح هو الذي تظهر فيه الحبيبات المطلوبة بمركز ساطع.

قم بتصوير فيديو لحركة الخرزات بتردد أكبر من 80 هرتز لمدة 500 إطار. قم بتحريك المغناطيس ليقترب من سطح العينة وسجل فيديو لحركة الخرزات عند كل موضع. بالنسبة للمسافات التي تتجاوز 5 ملم، تحرك بزيادات قدرها 1 ملم للمسافات التي تتراوح بين 1 و 5 ملم.

تحرك بزيادات قدرها 0.5 millimeter للمسافات التي تقل عن one millimeter، وبزيادات قدرها 0.25 millimeter. تتبع مركز الخرزات لكل مجموعة بيانات باستخدام ملاءمة Gaussian ثنائية الأبعاد. احسب القوة عبر تقلبات Brownian كما هو موضح في الإجراء المكتوب. تحقق من دقة القوى من خلال مراجعة حساب القوة عبر ملاءمة خطية لطيف القدرة.

من أجل إيجاد تردد القطع، يمكن العثور على العلاقة بين القوة المطبقة وتردد القطع في النص السابق؛ قبل ربط ببتيد الكولاجين بخلايا التدفق، قم بالتعبير عن بروتينات ببتيد الكولاجين وMMP one وتنقيتها. ابدأ بإضافة محلول الأجسام المضادة anti mic إلى خلية التدفق والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح لـ anti mic بالارتباط بسطح خلية التدفق، ثم قم بحجب خلية التدفق لمنع الارتباط غير النوعي للبروتينات باستخدام 5 mg/mL من BSA. أضف 150 pM من ببتيد الكولاجين واتركه ليرتبط بالجسم المضاد عبر M ttag لمدة 45 دقيقة.

اغسل الكولاجين الزائد باستخدام محلول PBS المنظم قبل إضافة حبيبات بحجم 2.8 ميكرومتر إلى خلية التدفق. يجب فصل هذه الحبيبات عن محلول حبيبات strep divid والمغلفة باستخدام مغناطيسات قوية، ثم إعادة تعليقها في محلول PBS. يجب تكرار هذه العملية ثلاث مرات.

تعد هذه الخطوة أساسية لضمان ارتباط الخرزات ذات حجم 2.8 µm بببتيد الكولاجين المثبت على السطح. بعد ذلك، أضف خرزات فائقة المغناطيسية مغلفة بـ streptavidin واتركها لتلتصق بجزيئات الكولاجين لمدة 45 دقيقة. وبمجرد تجميع خلية التدفق مع ببتيد الكولاجين والخرزات المغناطيسية، قم بتصوير خلية التدفق في المصيدة المغناطيسية.

تحت تأثير قوة منخفضة، تكون مجموعة فرعية من الخرزات ضعيفة أحيانًا، حيث تلتصق بالسطح بطريقة غير متخصصة. يضمن تطبيق قوة معتدلة تحرير هذه الخرزات. أضف الإنزيم المنشط إلى خلية التدفق.

في هذه الحالة، تم تنشيط MMP one مسبقاً عن طريق إضافة 3.5 millimolar PMA والحضن عند 37 °C لمدة ثلاث ساعات. وبمجرد إعادة إدخال خلية التدفق في جهاز الملاقط المغناطيسية، يتم تسجيل مقطع فيديو يشمل عدة مجالات رؤية، وهو ما ينتج عادةً عدة مئات من الخرزات الملتصقة. ويتوافق هذا القياس مع الزمن equals zero.

كرر عملية تسجيل عدة مجالات رؤية في نقاط زمنية منتظمة حتى تنفصل جميع الخرزات أو يتوقف حدوث المزيد من التحلل البروتيني الملحوظ. تمت معايرة الملاقط المغناطيسية لخرزات بحجم 1 ميكرومتر و 2.8 ميكرومتر. وباستخدام كل من مقدار تقلبات براون المرصودة وحساب تردد التلاشي (roll-off frequency) عند مواقع مغناطيسية مختلفة في تجارب التحلل البروتيني القسري، يمكن رسم العدد المعياري للخرزات المتبقية كدالة في الزمن لإيجاد معدل التحلل البروتيني.

ويمكن تكرار هذه العملية بتركيزات إنزيمية وقوى متفاوتة. تعتمد معدلات التحلل البروتيني على القوة المطبقة. وقد تم تحديد معدلات التحلل البروتيني عند 1 pN و 6.2 pN و 13 pN.

إن كسر الخرزات غير المحمية عند زمن يزيد عن 15 دقيقة يظل ثابتاً تقريباً عند 0.25 عبر التجارب المختلفة. وفي حالتنا هذه، أتاح لنا الاختبار قياس الكفاءة التحفيزية لـ MMP one كدالة للقوة المطبقة. ومن خلال تحليل البيانات، وجدنا أن الحلزون الثلاثي للكولاجين يجب أن ينفك محلياً قبل عملية التحلل البروتيني.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون خمس إلى ست ساعات إذا تم القيام بها بشكل صحيح. ومن المهم تذكر أن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 30 إلى 50 خرزة لكل مجال رؤية للحصول على دلالة إحصائية جيدة لبياناتك. ولا تنسَ أن PMA يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات، ومعاطف المختبر، وأقنعة الوجه أثناء إجراء هذه التجربة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس تأثير القوة على الانقسام البروتيني البروتيني لبروتينات مفردة باستخدام الملاقط المغناطيسية. تعد الملاقط المغناطيسية أداة رائعة لفهم التجارب الفيزيائية الحيوية للجزيئات المفردة. ويمكن توسيع هذه التقنية لتشمل تركيبات أخرى من البروتياز والركائز.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تقنيات مماثلة لفهم ديناميكيات البنية البروتينية، وكذلك لفهم البروتينات الأخرى التي ترتبط بـ RNA و/أو DNA أو تقوم بتعديلهما.