أسلوب التصوير الكالسيوم في تطوير شبكات القشرية

الهدف العام من هذا المقطع المرئي هو توضيح كيفية قياس نشاط الشبكة من شرائح القشرة الدماغية النامية باستخدام مؤشر فلوري حساس للكالسيوم. يتم تحضير شرائح الدماغ من القشرة الدماغية النامية لفأر صغير، حيث يتم تحميل كل من العصبونات والخلايا النجمية بعلامات تعتمد على الكالسيوم.

تعكس التغيرات في فلورة الأصباغ المعتمدة على الكالسيوم التغيرات في النشاط الخلوي. ويمكن صبغ الخلايا غير العصبية، بما في ذلك الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا البطانية، باستخدام أصباغ علّامة محددة. ويتم تسجيل نشاط الشبكة القشرية باستخدام التصوير متعدد الفوتونات بالفاصل الزمني، حيث يتم اكتشاف الخلايا داخل الشبكة عن طريق عمل مجموعة صور ثلاثية الأبعاد (3D stack) للمنطقة المستهدفة.

يمكن بعد ذلك تحليل التغيرات في الفلورة الخلوية عبر خلايا متعددة لقراءة نشاط الشبكة القشرية النامية. ويعد نمط النشاط المتزامن التلقائي للشبكة سمة مميزة للنشاط في الجهاز العصبي النامي. وقد لوحظ النشاط المتزامن في العديد من المناطق العصبية النامية المختلفة، بما في ذلك قشرة النخاع الشوكي السليمة ومحضرات المزارع العصبية المفككة خلال فترات النشاط التلقائي للخلايا العصبية، حيث يتم إزالة الاستقطاب لإطلاق نبضات مفردة أو دفقات من جهود الفعل التي تنشط العديد من القنوات الأيونية، بما في ذلك قنوات الكالسيوم المعتمدة على الجهد مما يؤدي إلى تدفق الكالسيوم.

تم قياس نشاط متزامن للغاية من الشبكات المحلية باستخدام أقطاب كهربائية مجالية أو مصفوفات متعددة الأقطاب. تتيح هذه الوسائل معدلات أخذ عينات زمنية عالية، ولكنها تعطي دقة مكانية أقل بسبب القراءة المتكاملة لنشاط الخلايا. ومن الممكن تحقيق دقة الخلية الواحدة في النشاط العصبي باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) في الفسيولوجيا الكهربائية للعصبونات الفردية لقياس معدلات إطلاق النبضات.

ومع ذلك، فإن القدرة على القياس من الشبكة تقتصر على عدد العصبونات التي يتم تثبيتها كهربائياً (patched) في آن واحد، وعادةً ما تكون عصبوناً واحداً أو اثنين فقط. وقد أتاح استخدام صبغات المؤشرات الفلورية المعتمدة على الكالسيوم قياس النشاط المتزامن عبر شبكة من الخلايا. وتوفر هذه التقنية دقة مكانية عالية وأخذ عينات زمنية كافية لتسجيل النشاط التلقائي للشبكة النامية.

تحتوي المؤشرات الفلورية الحساسة للكالسيوم، مثل إستر URA 2:00 AM، على مجموعات حمض كربوكسيلي قادرة على الارتباط بأيونات الكالسيوم. ويتم تنشيط هذه الأصباغ الفلورية بواسطة أطوال موجية ضوئية محددة، إما باستخدام مجهر فوتون واحد أو مجهر فوتونين. ويتغير عدد الفوتونات المنبعثة من الصبغة بشكل عابر عند الارتباط بالكالسيوم.

يُسجل هذا التغيير في عدد الفوتونات أو الفلورة كإشارة delta FF، وهو يقابل تغيراً في مستوى الكالسيوم داخل العصبون. ويعد قياس التغيرات في المؤشرات الحساسة للكالسيوم مقياساً مفيداً لقراءة أنماط نشاط الشبكة في الخلايا النامية. مرحباً، أنا ريانا مورتي، واسمي جولي أبوتس.

نحن من قسم الفسيولوجيا العصبية التفسيرية في جامعة أمستردام. لقد استخدمنا التصوير بالكالسيوم لدراسة النشاط الوظيفي في الأنسجة النامية في قشرة الدماغ لدى الفأر، وذلك باستخدام مؤشرات حساسة للكالسيوم عبر التصوير متعدد البؤر. يهدف هذا الفيلم القصير إلى توضيح كيفية استخدام هذه الطرق لقياس أنماط النشاط التلقائي والمستحث في الشبكات النامية في الجهاز العصبي.

أخرج الدماغ بسرعة من جمجمة فأر صغير لتقليل الضرر الذي قد يلحق بالدوائر العصبية. قم بتشريح الدماغ في محلول شرائح مبرد بالثلج. يحتوي محلول الشرائح على كلوريد الكولين بدلاً من الصوديوم المستخدم عادةً في A TSF للتسجيلات العصبية.

في هذه التجارب، نقوم بإعداد شرائح دماغية من القشرة المعوية لدماغ الفأر النامي. ضع قطعة من ورق الترشيح فوق طبق بتري وبللها ببضعة مليلترات من A TSF. انقل الدماغ إلى قطعة ورق الترشيح.

قم بتقسيم نصفي الكرة المخية باستخدام شفرة حلاقة ذات حافة واحدة. افصل نصفي الكرة عن بعضهما. أعد أحد النصفين إلى محلول التقطيع المبرد مع نصف الكرة المتبقي.

قم بإزالة المخيخ باستخدام شفرة الحلاقة. اقلب أحد الفصين على خط المنتصف الخاص به، وقم بإجراء قطع بعمق ملليمتر واحد تقريبًا من السطح الظهري مع إمالة الشفرة قليلاً نحو النهاية المنقارية. ثم اقلب الدماغ على.

يُنظف السطح المقطوع حديثاً باستخدام مسحة قطنية وملعقة معدنية. ثم يُنقل الدماغ إلى كتلة القطع المعدنية. يُدفع الدماغ برفق عن الملعقة باستخدام المسحة القطنية ليوضع فوق السطح الملاصق.

يتم قطع شرائح من الدماغ بسمك 300 Micrometer، وتكون سرعات القطع وتردد الشفرة للأنسجة الفتية عادةً أبطأ من تلك المستخدمة للأنسجة الأكثر نضجاً. وبمجرد الانتهاء من القطع، يتم نقل كل شريحة باستخدام ماصة زجاجية إلى غرفة الاحتفاظ، التي تحتوي على A TSF مؤكسج في درجة حرارة الغرفة. يحتوي A CSF على نسبة أعلى من المغنيسيوم إلى الكالسيوم مقارنة بمحلول A CSF.

تُترك الشرائح المستخدمة للتسجيل لمدة ساعة واحدة للتعافي. ولتحميل الخلايا بمؤشر معتمد على الكالسيوم أو علامة محددة للخلايا، يجب نقل الشرائح إلى غرفة مخصصة لإجراء عملية الصبغ. وعلى الرغم من توفر غرف تجارية، إلا أنه يمكن تجميع غرفة بسهولة من معدات المختبر القياسية بتكلفة زهيدة جداً.

لإنشاء غرفة صبغ، ستحتاج إلى المعدات المختبرية الأساسية التالية: طبقين من البتري البلاستيكي، ومحقنة سعة 10 milliliter، وقطعة من أنابيب السيليكا، وإدراج لزراعة الخلايا يحتوي على غشاء شبه نفاذ، وغراء فائق (super glue)، وثلاثة موصلات أنابيب صغيرة، وإبرة دقيقة. خذ طبق البتري الكبير واصنع ثقباً صغيراً في الجدار الجانبي باستخدام قضيب ساخن. خذ طبق البتري الصغير واصنع ثقباً بقطر مماثل يكون كبيراً بما يكفي لمرور أنبوب السيليكون من خلاله.

مرر جزءاً من أنبوب السيليكون عبر الثقب وشكّل حلقة بداخله في الطبق الصغير. استخدم الغراء الفائق (super glue) لسد الطرف المفتوح من الأنبوب. بعد ذلك، قم بلصق الجزء المتبقي من الأنبوب بالجدار الداخلي لطبق بتري الصغير.

ضع طبق بتري الصغير في مركز الطبق الكبير وثبته بالغراء. خذ الطرف المتبقي من أنبوب السيليكون ومرره عبر الفتحة الصغيرة الموجودة في الجدار الجانبي لطبق بتري. استخدم إبرة دقيقة لعمل ثقوب صغيرة في أنبوب السيليكون داخل طبق بتري.

اصنع الثقوب على فترات متباعدة بالتساوي لضمان اندماج غازي متجانس. استخدم مشرطاً مسخناً لعمل ذلك في بئر زراعة خلوية تحتوي على غشاء شبه نفاذ. قم بقص السنتيمتر الواحد العلوي من البئر لترك طبق ضحل يتسع للشرائح أثناء فترة الحضن.

ضع الطبق الضحل في مركز الطبق الصغير المحاط بأنابيب السيليكون المسامية. اصنع ثقباً بقطر يتراوح تقريباً بين نصف سنتيمتر وسنتيمتر واحد في غطاء الطبق الكبير. خذ محقنة بلاستيكية سعة 10 milliliter باستخدام مشرط ساخن.

قم بإجراء قطع مائل لإزالة طرف المحقنة. ضع الغراء الفائق على السطح المقطوع لأنبوب المحقنة. ثم قم بلصقه مباشرة فوق الفتحة الموجودة في غطاء طبق بتري الكبير.

قم بتوصيل موصل أنبوب بنهاية طرف المحقنة. ضع الطبق الضحل في مركز طبق بتري الصغير مع التأكد من أن أنبوب الغاز المسامي يحيط بالطبق. يتم بعد ذلك توصيل هذا الأنبوب بمصدر غاز كاربوغين لأكسجة الشرائح.

أثناء التحضين، أعد وضع غطاء الطبق الكبير، والمتصل مباشرة بمصدر الغاز عبر طرف المحقنة. سيعمل ذلك على توفير إمداد من غاز CO2 فوق الشرائح أثناء التحضين لتجنب تلاشي لون الصبغة. تُجرى جميع الإجراءات بأقل قدر ممكن من الضوء، مع الاحتفاظ بالصبغة والشرائح في الظلام.

املأ غرفة التصبغ بنحو 1.5 مل من A TSF من حامل الشريحة. ضع غرفة الواجهة في الداخل واملأها بـ 1 مل آخر من A TSF. من المهم الحفاظ على إمداد جيد بالأكسجين لإبقاء النسيج صحياً ولضمان تحميل الشريحة بشكل جيد.

تتم عملية الصبغ عند درجة حرارة 35 °C تقريبًا لتسهيل امتصاص الصبغة داخل الخلايا العصبية أثناء تسخين غرفة الصبغ. قم بتحضير صبغة الكاشف لـ fira 2:00 AM Ester. أضف 9 µL من DMSO مع 1 µL من onic acid إلى قارورة سعة 50 µg.

DMSO وحمض الأونيك. يعملان كعوامل نفاذية لتمكين الصبغة من العبور من خلال الغشاء الليبيدي. قم برج القارورة باستخدام جهاز Vortex لمدة 15 دقيقة لضمان ذوبان الصبغة تمامًا.

للتلوين، انقل كل شريحة إلى الواجهة. أدخلها في غرفة التلوين. ضع الصبغة مباشرة على المنطقة المستهدفة فوق الشرائح، ثم أغلق غطاء غرفة التلوين.

اترك الشرائح لتحتضن في الظلام لمدة تتراوح من 20 إلى 40 دقيقة اعتماداً على عمر الفأر المستخدم. وبعد فترة الاحتضان، انقل الشرائح مرة أخرى إلى حامل الشرائح لغسل أي صبغة زائدة متبقية. كما يمكن تكييف بروتوكولات الصبغ الخاصة بتصوير الكالسيوم لتناسب الأنسجة الأكبر سناً.

يتطلب ذلك خطوة إضافية من التحضين المسبق. انقل الشرائح القديمة إلى طبق تحضين مسبق ضحل مملوء بـ 3 mL من سائل CSF و 8 µL من محلول crema four بتركيز 0.5%. سخن المزيج إلى 35 °C لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، انقل الشرائح إلى الواجهة، وأدخلها في غرفة التلوين، واتبع إجراءات التلوين المعتادة.

من الممكن أيضاً صبغ هذه الشرائح للخلايا غير العصبية، وتحديداً الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا البطانية. يمكن استخدام Sulfur rumine 1 0 1 لصبغ الخلايا النجمية لـ sulfur domine. قم بتحضير محلول بتركيز 10 micromolar ثم انقل الصبغة الأرجوانية بواسطة الماصة فوق المنطقة المستهدفة في الشرائح.

اترك العينات لتحضن لمدة 15 دقيقة. انقل الشرائح مرة أخرى إلى غرفة الحفظ لإزالة أي صبغة زائدة. يمكن لـ FSE conjugate الخاص بـ tomato lectin أن يصبغ الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية.

بالنسبة لليكتين الطماطم، قم بتحضير محلول بتركيز 20 micrograms per milliliter. ضع الصبغة فوق المنطقة المستهدفة في الشرائح. اترك الشرائح لتحضن لمدة 45 minutes.

بعد ذلك، انقل الشرائح مرة أخرى إلى غرفة الحفظ. أثناء التصوير، يجب أن تكون الشرائح مستقرة تحت المجهر. عادةً ما يتم وضع مشبك معدني (metal harp) لتثبيت النسيج، ومع ذلك، قد يتسبب ذلك في تشويه سطح الشريحة بشكل غير متساوٍ، مما يؤدي إلى توفير مجال رؤية محدود فقط في نطاق التركيز للتصوير، وهو أمر يجب تجنبه.

يتم تثبيت هذه الشرائح في غرفة التسجيل باستخدام محلول البولي إيثيلين إيمين (POLYETHALINE) أو PEI. وPEI هو بوليمر يُستخدم لتعزيز التصاق الخلايا بالسطح لمدة ساعة واحدة على الأقل. وقبل وضع الشرائح في غرف التسجيل، املأ هذه الغرف ببضعة ملليلترات من محلول PEI لتغطية أرضية الغرفة.

أولاً، اشطف مادة PEI من الغرفة باستخدام الماء المقطر، يليه محلول CSF. انقل الشريحة إلى غرفة التسجيل وأزل محلول A CSF الزائد. ضع الشريحة في منتصف الغرفة باستخدام فرشاة رسم دقيقة.

أزل كل ما تبقى من A CSF باستخدام قطع صغيرة من ورق ترشيح ماص. احرص على التأكد من خلو حواف الشريحة من أي A CSF. وأخيراً، ضع نصف ملليليتر من A CSF بلطف فوق الشريحة دون تحريكها من الحجرة.

ضع الغرف في وعاء واجهة كبير مؤكسج واتركها لمدة ساعة إضافية في الظلام. يمكن تسجيل التغيرات في صبغات المؤشرات الحساسة للكالسيوم باستخدام المجهر فوتوني واحد أو فوتونين. نستخدم ليزر تيتانيوم سافير متصلاً بمجهر Olympus لتمكين التصوير ثنائي الفوتون في شبكاتنا العصبية.

بالإضافة إلى ذلك، نستخدم نظام trim scope من شركة L Vision biotech مع كاميرا EM CCD hammer MATSU لزيادة معدلات مسح الإطارات. يتم وضع غرفة الشرائح تحت المجهر مع تدفق مستقر من A-T-S-F-A-T-S-F المؤكسج الذي يحتوي على 1.6 millimolar من الكالسيوم و 1.5 millimolar من المغنيسيوم، ويتم تسخينه إلى حوالي 30 degrees C في التجهيزات باستخدام الضوء الأبيض.

حدد المنطقة المراد دراستها في الشريحة وقم بضبط التركيز على السطح. أطفئ الأنوار وأغلق باب خزانة التسجيل، وذلك لتقليل مستويات الضوء الخلفي.

تتوفر العديد من حزم البرامج التجارية أو مفتوحة المصدر لتسجيل الصور وتحليلها. نستخدم في مختبرنا برنامج inspector من شركة Lavis Biotech لعملية الحصول على الصور. لبدء التصوير، اختر وضع كاميرا CCD للكشف. ثم اضبط الطول الموجي المناسب للمؤشر الخاص بك.

بالنسبة لـ fira 2:00 AM Ester، قمنا بضبط الإثارة على 820 nanometers في برنامج trim scope. اختر وضع المسح 64 B. ثم حدد الحجم الأمثل لمجال الرؤية ودقة البكسل لمنطقة الاهتمام الخاصة بك.

اختر معدل إطارات مناسباً وتدويراً للبكسلات إذا لزم الأمر لأخذ عينات الصور. افتح غالق الليزر استعداداً للتصوير المستمر. استخدم وضع التصوير المستمر.

اضبط الكسب وكثافة الليزر وركز على الشبكة العصبية التي ترغب في تصويرها. أوقف المسح الضوئي. حدد إعدادات التصوير الفاصل الزمني (time-lapse) لمعدل الإطارات ومدة التسلسل.

بعد التصوير بفاصل زمني، قم بعمل مكدس Z (Z stack) من الصور بحيث يغطي 20 ميكرون فوق و20 ميكرون تحت، وبخطوات قدرها ميكرون واحد. يُستخدم مكدس Z هذا للكشف عن الخلايا أثناء التحليل. قم بتصدير الملفات المسجلة على شكل مكدس من صور TIFF.

ختاماً، لقد استعرضنا استخدام مؤشرات الكالسيوم لقياس نشاط الشبكة التلقائي المتزامن في القشرة الدماغية النامية. ويمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول المنهجية والكواشف في أوراق البيانات المرفقة بهذا الفيلم لتمكينكم من إعداد هذه التقنية في مختبراتكم الخاصة.