تأكيد المسار الأيضي والاكتشاف من خلال ¹³ C - وضع العلامات من الأحماض الأمينية Proteinogenic

الهدف من هذا البروتوكول هو دراسة التمثيل الغذائي البكتيري باستخدام تحليل التمثيل الغذائي بمساعدة الكربون 13. في البداية، يتم تنمية الميكروبات في وجود ركائز كربونية موسومة، والتي تندمج في البروتينات الميكروبية. بعد ذلك، يتم حصاد الميكروبات واستخلاص الأحماض الأمينية، ثم إجراء عملية التحلل المائي والاشتقاق.

يتم تطبيق العينات على جهاز كروماتوغرافيا الغاز ومطياف الكتلة أو GCMS. ومن خلال تتبع مسارات انتقال الذرات بين المستقلبات في الشبكة الكيميائية الحيوية، يمكن تحديد المسارات الاستقلابية الوظيفية التي استخدمها الميكروب. أنا بيرت بورلا.

يمكن استخدام الطريقة التي نقدمها هنا كـمكمل لعلم النسخ وعلم البروتينات لتحديد المسارات الأيضية في الميكروبات. لقد استخدمنا هذه التقنية لاستقصاء الميكروبات التي تقوم بعملية التمثيل الضوئي، مثل البكتيريا الزرقاء، بحثاً عن استخدام الكربون الميوت روفي أو الهتروت روفي. في هذا الفيديو، سنستخدم ANOTHE 5 1 1 42 كسلالة نموذجية لتوضيح استخدام ركائز الكربون الموسومة لاكتشاف وظائف إنزيمية جديدة.

سأقوم أنا ولي يو وتشو يانغ فانغ بتوضيح هذا الإجراء. ابدأ هذا الإجراء بزراعة بكتيريا cyana thesei في وسط غير مُعلّم. عندما تصل البكتيريا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسطة، قم بتلقيح 3% من الحجم في الوسط المُعلّم بالكربون 13.

وبعد ذلك، ولتجنب إدخال كربون غير معلم من المزرعة الفرعية الملقحة الأولية إلى الوسط المعلم نفسه في مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط، وعندما تصل بكتيريا Cy Thesei المعلمة بالكربون 13 إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط، يتم حصاد 10 milliliters عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الراسب في 1.5 milliliters من حمض الهيدروكلوريك بتركيز ستة molar وانقله إلى قارورة زجاجية شفافة ذات غطاء لولبي مخصصة للكروماتوغرافيا الغازية أو قارورة GC.

أغلق القوارير بإحكام وضعها في فرن عند درجة حرارة 100 °C لمدة 24 ساعة لتحليل بروتينات الكتلة الحيوية مائيًا إلى أحماض أمينية. ينتج عن التحلل المائي لكريات الكتلة الحيوية 16 من الأحماض الأمينية العشرين الشائعة. بعد التحلل المائي، انقل محلول الأحماض الأمينية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 mL، ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 20,000 ×g لمدة خمس دقائق لترسيب الجسيمات الصلبة.

بعد عملية الطرد المركزي، يتم نقل السوائل الطافية إلى عبوات GC جديدة لإزالة الجسيمات الصلبة الموجودة في محلول التحلل المائي، وذلك لمنع دخولها إلى عمود GC. بعد ذلك، يتم اشتقاق الأحماض الأمينية لجعلها متطايرة من أجل فصلها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز. أذِب العينات المجففة باستخدام 150 µL من رباعي هيدرو الفوران THF و 150 µL من N,O-بسيليلات ثنائي ميثيل تري فلورو ميثيل.

باستخدام كاشف الاشتقاق Acetamide, T-B-D-M-S، يتم تحضين جميع العينات في فرن في درجة حرارة تتراوح بين 65 و 80 °C لمدة ساعة واحدة. يتم رج العينات بواسطة جهاز Vortex من حين لآخر لضمان ذوبان المستقلبات في الأنبوب. ثم تُوضع العينات في جهاز الطرد المركزي بسرعة 20,000 ×g لمدة 10 دقائق، وبعد ذلك يُنقل السائل العلوي إلى أنابيب GC جديدة.

يجب أن يكون الراشح عبارة عن محلول أصفر اللون ورائق. تكون درجات حرارة GC كما يلي: التثبيت عند 150 °C لمدة دقيقتين، ثم الرفع بمعدل 3 °C في الدقيقة وصولاً إلى 280 °C.

ارفع درجة الحرارة بمعدل 20 °C في الدقيقة وصولاً إلى 300 °C، ثم ثبتها لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، وبالنسبة لعمود GC بطول 30 متر، اضبط تأخير المذيب (solvent delay) على خمس دقائق تقريباً، ونطاق نسبة الكتلة إلى الشحنة (mass to charge ratio) ما بين 60 و500. قم بتحليل العينات بواسطة GCMS باستخدام نسبة تقسيم (split ratio) تتراوح من 1:5 إلى 1:10، وحجم حقن قدره 1 µL، وغاز حامل من الهيليوم بمعدل تدفق 1.2 mL/min بعد التشغيل.

قم بتحليل بيانات GCMS باستخدام Microsoft Excel. يوضح هذا الشكل زمن الاحتفاظ في GC وقمم نسبة الكتلة إلى الشحنة الفريدة لكل حمض أميني. عادةً ما يتم تقسيم الأحماض الأمينية المشتقة بواسطة T-B-D-M-S بوضوح بواسطة MS إلى شظيتين مشحونتين: الشظية M ناقص 57، والتي تحتوي على الحمض الأميني بالكامل، والشظية M ناقص 159، التي تفتقر إلى مجموعة ألفا كربوكسيل للحمض الأميني في حالة الليوسين والأيزوليوسين.

كانت ذروة M ناقص 57 متداخلة مع ذروات كتلية شظوية أخرى. ويمكن استخدام N ناقص 15 لتحليل عملية وسم الأحماض الأمينية بأكملها. كما تظهر مجموعة F 3 0 2 غالباً في معظم الأحماض الأمينية، وهي تحتوي فقط على مجموعة ألفا كربوكسيل الأولى والكربونات الثانية في الهيكل الأساسي للحمض الأميني.

ومع ذلك، نظرًا لأن هذه القمة (Ms.Peak) غالبًا ما تتسم بنسب ضوضاء إلى إشارة عالية، فإن F 3 0 2 لا يُوصى به للتحليل الكمي للتدفقات الأيضية. يؤدي اشتقاق الأحماض الأمينية أو المستقلبات المركزية إلى إدخال كميات كبيرة من النظائر المسمى طبيعيًا، بما في ذلك carbon 13 و oxygen 18 و silicon 29 و silicon 30. ويمكن تصحيح ضوضاء القياس الناتجة عن النظائر الطبيعية في طيف الكتلة الخام أو توزيع النظائر باستخدام برامج منشورة.

يتم تقديم بيانات الوسم النظيري النهائية في صورة كسور كتلية. على سبيل المثال، M zero وM1 وM two وM three وM four، والتي تمثل الشظايا التي تحتوي على صفر إلى أربعة ذرات كربون موسومة بالكربون 13 cyana. لا يحتوي 5 1 1 2 على إنزيم three anine ammonia lyase، الذي يحفز تحويل three anine إلى two keto butyrate في مسار تخليق isle النموذجي.

وبناءً على ذلك، ولتحديد مسار الإيزولوسين في هذا الكائن الحي، تم استزراع سلالة Cyana thesei 51142 في وسط ASP2 مع 54 ملي مولار من الجلسرول، وتم تحليلها باستخدام تقنية GC-MS كما هو موضح في هذا الفيديو. وكما يظهر هنا، تستخدم سلالة Cyana thesei 51142 الجلسرول المسمى في الموضع الثاني كمصدر رئيسي للكربون، وقد لاحظنا أن الثريونين والألانين، اللذين يعد البيروفات طليقتهما، يحتويان على ذرة كربون مسمى واحدة، بينما تم تسمية الإيزولوسين بثلاث ذرات كربون. لذا، فإن تخليق الإيزولوسين في سلالة Cyana thesei 51142 لا يمكن أن يكون مشتقاً من مسار الثريونين الذي تستخدمه معظم الكائنات الحية. ومن ناحية أخرى، أظهر اللوسين والإيزولوسين أنماط تسمية متطابقة بناءً على الشظية M-15 والشظية M-159.

على سبيل المثال، أظهر النظير أو البيانات من N-15 التي تحتوي على أحماض أمينية غير مُجزأة وسمًا متطابقًا لكل من الليوسين وISO الليوسين. وبالتالي، يجب أن يتم تخليق الليوسين وISO الليوسين من السلائف نفسها، وهي البيروفات وacetyl-CoA. وتتوافق هذه الملاحظة مع انتقال الكربون المسمى في مسار Citra malate لتخليق isle.

يمكن استخدام هذه الطريقة لاستقصاء عملية التمثيل الغذائي لمجموعة متنوعة من الميكروبات، وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذها من البداية إلى النهاية في غضون أسبوع واحد تقريباً.