رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

مرحباً. نقدم في هذا الفيديو تجربة كاملة لتتبع الجسيمات المفردة. وقد تم تصميم خوارزمية مخصصة بالكامل بالتعاون مع خبراء image ISIS. سنستخدم خلال هذا الفيديو مستقبل عامل نمو البشرة كنموذج لوصف طريقة هذه التقنية.

يُعد مستقبل عامل نمو البشرة بروتيناً عبر غشائي. سيتم وسم هذا المستقبل باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة، والذي يتم اختزاله للإبقاء على جزء A a B فقط. يتم بيوتينية جزء A a B، وبعد ذلك يتم ربطه بالستريبتويدين الموجود في النقطة الكمومية، وبذلك سيتعرف النظام بدقة على مستقبل EGF.

هدفنا هو تقديم رؤية شاملة لديناميكيات مستقبلات سطح الخلية. وبالفعل، يمكن أن تنحرف المسارات الجزيئية عن الانتشار الحر من خلال تقيدها داخل نطاقات نانوية. فعلى سبيل المثال، قد يكون هذا مؤشراً على وجود تفاعل أساسي مع شركاء التأشير أو السقالات الجزيئية، على سبيل المثال.

نهدف إلى وصف هذه الأحداث بشكل شامل من خلال رسم خرائط لها عبر الخلية، وهو ما يتطلب العمل بدقة زمنية عالية في تقنية SPECT جنبًا إلى جنب مع كثافة وسم عالية. ومن هنا، أطلقنا على هذا النهج اسم تتبع الأهداف المتعددة (multi target tracing). وتتمثل الخطوة الأولى من التجربة في تحضير العينة.

نعمل على خلايا حية بوجود أو بدون مضادات حيوية. نستخدم هنا خلايا cost seven، التي تعبر داخلياً عن مستقبلات EGF. بعد فصل الخلايا، نحتاج إلى تأكيد العدد بدقة لضمان وجود نفس عدد الخلايا في كل بئر من آبار المختبر.

يعد تحديد عدد دقيق من الخلايا أمراً بالغ الأهمية لزيادة القدرة على التنبؤ بعدد النقاط الكمومية لكل خلية. بعد توزيع الخلايا في الآبار، يجب تحضين العينة لمدة 24 ساعة عند 37 °C مع 7% من CO2. الخطوة التالية هي تحضير النقاط الكمومية المقترنة بالأجسام المضادة. النقاط الكمومية هي جسيمات نانوية فلورية صغيرة.

تتمتع هذه الجسيمات بأهمية كبيرة هنا لأنها ساطعة ومستقرة للغاية مقارنة بالمجسات والإشارات الفلورية التقليدية. وتعد نسبة الضوضاء (noise ratio) مهمة جداً لهذا النوع من التجارب. وفي هذه الحالة، نستخدم وسطاً كاملاً لإشباع الجوانب المحيطة بالنقاط الكمومية (quantum dots) ومنع التكتل.

بعد ذلك، قمنا بخلط النقاط الكمومية مع البروتينات أو الأجسام المضادة ذات الصلة الحيوية بنسبة واحد إلى واحد، وذلك للحصول على عدد أكبر من النقاط الكمومية أحادية التكافؤ من الناحية الإحصائية. وفي هذه التجربة، نستخدم قطعة Fab ضد مستقبل EGF، تم إنتاجها في المختبر من أجسام مضادة أحادية النسيلة وهي مستهدفة بالبيوتين. وخلال فترة الحضن التي تستغرق حوالي 15 دقيقة، يمكنك التحكم في التكتل والتجانس باستخدام جهاز هزاز بسرعة 1,200 دورة في الدقيقة وعند درجة حرارة 25 °C.

عندما يصبح الخليط جاهزاً، يمكنك إضافته إلى الخلايا. قم بإزالة الوسط من البئر برفق شديد لمنع انفصال الخلايا عن طبق الزرع، ثم أضف الكمية المطلوبة من الخليط لتجربتك. في هذه الحالة، سنضيف 100 microliters من الخليط لكل بئر.

بعد إضافة الخليط، يمكنك تحضين الخلايا لمدة 15 دقيقة، وذلك عند 37 درجة مئوية مع 7% من CO2. بعد هذا التحضين، قد تجد عدداً كبيراً من النقاط المزدوجة المتكررة العالقة في الوسط.

يجب إزالة هذه النقاط الكمومية قبل التصوير، وذلك بسبب الضوضاء التي تسببها. ولهذا السبب نحتاج إلى غسل كل بئر عدة مرات، وفي هذه الحالة، خمس مرات للتنظيف.

استخدم وسط تصوير خالٍ من الفلورة الذاتية. نستخدم هنا محلول HBSS المنظم مع aps. الآن أصبحت خلاياك جاهزة.

حان الوقت للانتقال إلى إعدادات عملية الاستحواذ. يتكون الإعداد من أربعة أجزاء رئيسية: مجهر مقلوب، وكاميرا ذات حساسية بصرية، ومصباح زئبقي قوي، وحاضنة للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة. يمر الضوء المنبعث من المصباح الزئبقي عبر ليف بصري وعبر عجلة مرشحات قبل أن يسقط على العينة.

يتم ترشيح الفلورة المنبعثة من العينة وجمعها بواسطة كاميرا E-M-C-C-D الموجودة على اليسار. نحن نستخدم حالياً عدسات شيئية زيتية بفتحة عددية 1.3 و 1.49. الخطوة المركزية في هذه التجربة هي عملية الاستحواذ ذاتها.

بمجرد أن تصبح الخلايا في بؤرة التركيز، نقوم بفحص خلية ممثلة ذات وسم قوي. في حالة النقاط الكمومية، نقوم أولاً بالتقاط صورة واحدة بالضوء الأبيض النافذ، والتي يمكن استخدامها لاحقاً للتحقق من مظهر الخلية والحدود الخاصة بـ LA podia. بعد ذلك، نقوم بالتقاط فيديو بمعدل 36 millisecond عادةً، وهو أسرع معدل متاح في الإطار الكامل.

نستخدم كاميرا CCD مضاعفة الإلكترونات للوصول إلى حساسية الجزيء الواحد مع نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية تكون أعلى من 20 decibel على الأقل. وعادة ما تكون هذه النسبة حوالي 25 decibel، ونقوم عادةً بالتقاط 300 إطار. ولتقييم مجموعة بيانات معينة، تحتاج فقط إلى تقديم المسار إلى الدليل الذي يحتوي على ملفات الفيديو.

ثم عند كتابة الأمر، يتم إعادة ربط النص في MetLab أو كتابة الأمر MTT 23 I، والذي يعرض أولاً واجهة رسومية تسرد جميع المعلمات المستخدمة لبدء التحليل المؤتمت بالكامل. يتم إجراء تحليل MTT الأساسي على كل إطار، من خلال تنفيذ ثلاث مهام رئيسية، أولها الكشف في كل بكسل عن وجود أو غياب هدف كمي.

بعد ذلك، يتم إجراء تقدير لكل عملية كشف للمعاملات ذات الصلة بالهدف، مثل موضعه في البكسل، وشدة الإشارة، وما إلى ذلك. وأخيراً، يتم إجراء إعادة توصيل للأهداف الجديدة، وذلك باستخدام المسارات التي تم بناؤها بالفعل عبر الإطارات السابقة لكل بكسل.

عند النظر في منطقة فرعية محلية، نقوم بالمقارنة بين فرضيتين للوجود، إما وجود ضجيج فقط أو وجود إشارة. وبناءً على دالة انتشار النقطة، يمتلك ModuLite قمة رفيعة. نستخدم عتبة تضمن انخفاض الإنذارات الكاذبة بحيث تكون أقل من عملية اكتشاف واحدة لكل إطار لكل هدف مكتشف.

نقوم بعد ذلك بإجراء مواءمة مربعات صغرى لنمط غاوس لتقدير عرض وارتفاع وموضع القمم المكتشفة. ويوفر هذا بشكل ملحوظ موضع الخلية الدقيق للصبغة، بدقة تتراوح عادةً بين 10 إلى 20 نانومتر لنسب الإشارة إلى الضوضاء النموذجية؛ حيث يمكن أن تكون القمم ذات الكثافة العالية متقاربة جدًا، وقد تعيق القمم القوية القمم الأضعف، ولمعالجة ذلك، نقوم بتخفيض القمم المكتشفة من الصورة الأولية.

ومرة أخرى، يمكن لعملية الكشف عن المتبقي أن تعيد تحريف 10% من القمم عادةً. إن الوصول إلى كشف شامل تقريباً يكون مثمراً جداً لإعادة توصيل دقيقة. بعد ذلك، يتم مطابقة مجموعة الأهداف الجديدة مع مجموعة الآثار السابقة لهذا الحدق.

من أجل تعيين كل أثر إلى هدف إن أمكن، والتعامل مع الوميض المحتمل، نستخدم جميع المعلومات الإحصائية المتاحة التي تم الحصول عليها من خطوة الكشف. وبناءً على ذلك، لا يتم تعيين الأهداف لمجرد كونها الأقرب إلى الأثر. وفي حالة حدوث تعارضات، عندما قد تتقاطع الآثار، مما يعني تداخل مناطق البحث ذات الصلة، سنأخذ في الاعتبار القيمة الإحصائية للكثافة، والسرعة، والعرض، والوميض لكل من الآثار والأهداف على حد سواء.

يؤدي هذا إلى الحصول على درجة إعادة توصيل مثالية إحصائياً. وتسمح هذه الاستراتيجية بتجنب تحيز إعادة التوصيل نحو الجيران الأقرب قدر الإمكان، وهو ما يعني الحركة الأبطأ. نستخدم بعد ذلك دالة لتقييم الحصر العابر المحتمل ضمن المسارات.

ترتبط هذه الدالة عكسياً بالانتشار المحلي كما حدده Sexton Simpson ومعاونوه. ويسمح تطبيق حد عتبة بتحديد نوبات الحصر من عدمها. ومن خلال تكرار هذه العملية على كافة المسارات، يمكننا في النهاية رسم خريطة لديناميكيات الغشاء من حيث الحصر العابر وأدلة التباطؤ، ويمكن تمثيل ذلك.

وبدلاً من ذلك، وعند استخدام القيم الثنائية أو المنفصلة لمؤشر الحصر هذا، سيقوم MTT تلقائياً وبشكل افتراضي بتنفيذ هذه المهام، مع حفظ معاملات الصف لكل قمة في ملف eski لكل فيديو، وذلك لإجراء المزيد من الاستقصاءات المتقدمة. وتشمل النتائج النموذجية مثل خريطة المسارات فوق كل خلية ومخططات توزيع المعاملات ذات الصلة، وكثافات القمم، ونسبة الإشارة إلى الضجيج، والقيم المحلية الناقصة، وبذلك يمكن تكييف هذا الجانب بسهولة مع أي استقصاء مخصص. سيلخص هذا الفيديو الآن النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها بواسطة MTT.

يكمن جزء كبير من العمل في تطوير الخوارزمية، والتي قد تحتاج إلى تكييفها مع أبحاث مخصصة مثل أنماط الحركة أو التفاعلات. ومع ذلك، فإن تشغيل MTT أمر بسيط للغاية؛ إذ يتعين على المستخدمين فقط تحسين بعض المعلمات مثل الحدود المكانية والزمانية.

عند تطوير تقنية MTT، هدفنا إلى إعادة النظر بشكل كامل في الخيارات التحليلية المستخدمة لكل مهمة. وقد قمنا بتحسين العملية وفق محورين تحديين؛ الأول هو التعامل مع الكثافات العالية للحصول على أفضل معلومات مكانية عبر السطح، والثاني هو التعامل مع نسبة إشارة إلى ضوضاء (SNR) ضعيفة، وهو ما يسمح عادةً بالعمل بمستويات إزالة منخفضة وسرعة عالية، حيث يمكن تفسير الحصر على أنه بصمة لتفاعل أساسي.

قد تتفاعل مستقبلات الغشاء مع الهيكل الخلوي الموجود تحت الغشاء أو النطاقات البروتينية الدهنية، على سبيل المثال. ويمكن استقصاء مثل هذه الأحداث من خلال تباينات الحصر في المكان والزمان. كما يمكن مقارنة القياسات الديناميكية بنهج تكميلية مثل FRA F Cs، أو freight.

كود المصدر المفتوح متاح للأبحاث الأكاديمية. ويمكن تحميله من صفحة الويب الخاصة بنا على CML dot univ if an S fr في صفحة الفرق الخاصة بنا، والتي توفر رابطاً للتحميل. كما نرحب بتواصل الجهات الصناعية المهتمة معنا.

نود أن نتقدم بشكر خاص لأعضاء فريقنا وللمرافق المشتركة على دعمهم ومناقشاتهم المثمرة. هذا المشروع مدعوم بتمويل من CNRS في c MAA University Pac Region National de La، ومؤسسة Medical مدعومة من league controller. شكراً للمشاهدة.