تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين

يهدف بروتوكول mass squirm إلى قياس نشاط إنزيم lysine demethylase باستخدام الميثيلة النظيرية ومطيافية الكتلة maldi؛ أولاً، يتم إجراء تفاعلات إزالة الميثيل المحفزة إنزيمياً على ببتيدات تحتوي على بقايا lysine مُميثلة. بعد ذلك، يتم إجراء ميثيلة كيميائية لنواتج الببتيد الناتجة عن تفاعل demethylase باستخدام formaldehyde مُدُتَر، لإنتاج ببتيدات مُميثلة بشكل موحد تتأين بالطريقة نفسها عبر maldi. ثم يتم الانتقال إلى قياس كمية كل نوع من الببتيدات باستخدام مطيافية الكتلة maldi مع مراعاة التداخل النظيري. ومن أجل تحديد الكميات النسبية للببتيدات غير المُميثلة والمُميثلة أحادياً وثنائياً وثلاثياً، تحدد نتائج mass squirm الكميات النسبية لكل ناتج من تفاعل demethylase بناءً على التغيرات في الكتلة.

تتمثل الميزة الأساسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل قياس الطيف الكتلي الروتيني، في أن درجة الكتلة تأخذ في الاعتبار الاختلافات في التأين بين الببتيدات الميثيلية المختلفة. وقد خطرت لنا فكرة هذا النهج لأول مرة عندما طورنا طريقة لقياس مستويات أستلة الهيستون باستخدام أنهيدريد الأسيتيك الثقيل نظائرياً. ويكمن التحدي في هذه التقنية في استخراج بيانات مساحة القمة، والتي قد تصبح معقدة بسبب تداخل الأغلفة النظائرية للببتيدات.

لإجراء تفاعل إزالة الميثيل، اخلط 125 nanograms من إنزيم lysine specific demethylase one المؤتلف مع 0.25 micrograms من ببتيد dimethyl hisone H three المبيوتني في حجم نهائي قدره 20 microliters من محلول demethylase buffer. قم أيضاً بتحضير عينة ضابطة تحتوي على 0.25 micrograms من الببتيد بدون إنزيم LSD one. يتم تحضين أنابيب التفاعل والعينة الضابطة لمدة ساعتين عند 37 degrees Celsius. بعد ذلك، ولتحضير حبيبات R two ذات المسام بحجم 20 micron، اخلط أحجاماً متساوية من الحبيبات والميثانول.

ثم أضف 10 أحجام من حمض TFA حمض الفورميك، وأضف ثمانية ميكرولتر من الخرز المسامي إلى كل عينة ورجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي هذه الأثناء، قم بتهيئة اثنين من رؤوس C 18 zip tips. وذلك عن طريق السحب والضخ مرتين باستخدام 20 ميكرولتر من 0.1%TFA، وأربع مرات باستخدام 70%aceto nitrile 0.1%TFA، وأربع مرات أخرى باستخدام 0.1%TFA.

بعد ذلك، يتم تحميل العينتين على رؤوس Zip tips المهيأة. وباستخدام الماصة، يتم دفع الحجم عبر راتنج C 18. تُكرر هذه العملية حتى يتم دفع الحجم الكلي لكلتا العينتين عبر رؤوس Zip tips.

بعد ذلك، تُغسل رؤوس Zip tips مرتين باستخدام 20 µL من 0.1%TFA، ثم تُستخلص العينات في 40 µL من محلول الـ elution buffer، ثم تُجفف تماماً باستخدام جهاز SpeedVac concentrator. أولاً، يُعاد تعليق العينة في 100 µL من محلول phosphate buffer بتركيز 50 mM وpH 7.4. ثم يُضاف 8 µL من bore dimethyl amine و 16 µL من derated formaldehyde.

يُحضن الخليط عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين. تُكرر عملية الميثيلة الاختزالية بإضافة boring dimethyl lamine وdeuterated formaldehyde ثم يُحضن الخليط لمدة ساعتين. وفي المرة الثالثة، يُضاف boring dimethyl lamine ويُحضن الخليط عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 ساعة.

أوقف التفاعل بإضافة 12.5 µL من محلول tris بتركيز 1 M ورقم هيدروجيني pH 7.4، ثم ابدأ بتجفيف العينات تماماً باستخدام جهاز تركيز SpeedVac. بعد ذلك، أعد تعليق عينات التحكم وعينات تفاعل نزع الميثيل في 100 µL من محلول منظم الفوسفات بتركيز 50 mM ورقم هيدروجيني pH 7.4.

أضف الآن 8 µL من الخرز المسامي إلى عينات التحكم وعينات تفاعل demethylase، ثم اجمعها باستخدام رؤوس zip tips كما هو موضح سابقاً. قم بإخراج المواد في أحجام قدرها 2 µL على لوحة عينات MALDI واتركها لتجف في درجة حرارة الغرفة حتى تتبلور. انتقل بعد ذلك إلى تحليل العينات باستخدام مطياف الكتلة.

افتح ملفات الطيف في برنامج العمل وقم بتصديرها إلى برنامج M over Z. ثم تحقق من نواتج التفاعل باستخدام مطيافية الكتلة الترادفية. أولاً، حدد نسبة مساحة القمة لنظائر الكربون 13 C two والكربون 13 C four بالنسبة لقمة النظير الأحادي لعينة الضبط.

استخدم هذه النسب المحسوبة لتحديد الكمية النسبية للببتيد الموجودة في كل تعديل. حالة عينة تفاعل إنزيم نزع الميثيل. يمكن استخدام إنزيم LSD الواحد بفعالية في تقدير كمية نزع ميثيل الليسين عبر مطياف الكتلة.

بما أن تفاعل الضبط لا يخضع للمثيلة الاختزالية، فإنه يشير إلى الغلاف النظائري النموذجي لهذا الببتيد. وتحدد مساحات القمم الناتجة نسب الخلفية للببتيد الموجود في carbon 13 C two و carbon 13 C four. وتسمح الحالات النظائرية ومساحات القمم من طيف الكتلة لتفاعل الضبط بتحديد الكمية النسبية للببتيد الموجود في كل حالة تعديل. وفي تفاعل نزع المثيلة، تحدد مساحات القمم من تفاعلات الضبط ونزع المثيلة هذه أن 33.7% dimethyl lysine 4 42 و 0.3% monomethyl lysine four و 24% unmethylated lysine four.

يوفر نهج قياس الكتلة هذا رؤى أساسية في مجال علم فوق الجينات للهستونات، مثل كيفية مساهمة إزالة الميثيل من بقايا ليسين الهستون في أمراض مختلفة. وبينما تم تطبيق مقايسة الميثيلة هذه لدراسة إنزيمات إزالة الميثيل، يمكن استخدامها أيضاً لدراسة إنزيمات نقل الميثيل.