Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

تم تحسين هذا البروتوكول لتغليف الخلايا الجذعية الجنينية البشرية متعددة القدرات وتمايزها إلى عصبونات دوبامينية في نظام ثلاثي الأبعاد. أولاً، تُعالج المستعمرات بمثبط ROCK أو RI ويتم تفكيكها إلى خلايا مفردة مع خلطها بـ sodium alginate وتمريرها عبر جهاز التغليف. يستمر العلاج بـ RI لمدة ثلاثة أيام، ثم تُنقل الخلايا المغلفة إلى خلايا PA six وتُترك لتتمايز لمدة 28 يوماً.

وفي نهاية المطاف، يُظهر تحليل التعبير الجيني والبروتيني كفاءة أعلى في توليد العصبونات الدوبامينية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية المحددة مقارنة ببروتوكول التمايز ثنائي الأبعاد (2D) الحالي في أننا نعمل على إكثار هذه الخلايا وتمايزها في بيئة ثلاثية الأبعاد (3D)، حيث تتيح لك هذه البيئة ثلاثية الأبعاد فرصة إكثار الخلايا بكثافة عالية. كما أنها توفر فرصة لتحقيق تفاعل أفضل بين الخلايا من أجل التمايز.

وثالثاً، تمنحكم هذه الطريقة كفاءة أفضل في التمايز في المراحل اللاحقة. كما أود أن أضيف أن هذه التقنية المحددة يمكن تكييفها لأنواع أخرى من الخلايا التي يمكننا إكثارها في بيئة ثلاثية الأبعاد. وتذكروا أيضاً أنه على سبيل المثال، تم تحسين هذه التقنية بناءً على استخدام مثبط Rock معين يمنع موت الخلايا المبرمج (apoptosis) ويمنع أيضاً انفصال الخلايا عن أطباق المزرعة.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات في البداية لأن هذه التقنية لا تُطبق عادةً في زراعة الأنسجة. لقد تم تحسين تقنية التغليف التالية بناءً على الدراسات الملخصة للدكتور Dean والدكتور Chad حول تطبيق نوع alginate المثبط لـ R، وتركيز alginate، وإعدادات جهاز التغليف. ستقوم الآن Jamie وKim، طالبة الدكتوراه من مختبرنا، بتوضيح هذا البروتوكول.

أضف 25 milliliters من محلول الجيلاتين المعقم بتركيز 0.1% إلى 275 milligrams من ألجينات الصوديوم المنقاة في أنبوب معقم سعة 50 milliliter، ثم استخدم جهاز الفورتكس لإذابة مسحوق الألجينات جزئياً. بعد ذلك، ضع الأنبوب على جهاز خلط مداري بسرعة 10 times G طوال الليل. أخيراً، أضف كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 9% إلى محلول الألجينات.

قم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس لمدة 30 ثانية ثم استخدم جهاز الطرد المركزي عند 95 ×g لمدة خمس دقائق. احفظ محلول الألجينات عند درجة حرارة 4 °C. أولاً، وفي بيئة مظلمة، قم بمعالجة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مسبقاً باستخدام أوساط زرع مكملة بـ 10 µM من مثبط ROCK.

يتم التحضين لمدة ساعتين عند 37 °C. الآن تُغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS لإزالة الخلايا إنزيميًا. يُضاف accutane ويُحضّن لمدة 10 دقائق.

عند درجة حرارة 37 °C، قم بحصد الخلايا بلطف باستخدام كاشطة الخلايا وانقلها إلى أنبوب سعة 15 ml. قم بتعادل Accutane بإضافة حجم مساوٍ من وسط SL. بعد ذلك، مرر الخلايا المعادلة عبر مرشح بمسامية 40 micron إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 ml.

استخدم الآن مقياس خلايا الدم (hemo cytometer) لتعداد الخلايا. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وتخلص من السائل الطافي بعناية. ثم اغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول مسخن مسبقاً.

كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9%. قم بطرد مركزي لراسبك وتخلص من الطافي. لتغليف الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، ابدأ بإعادة تعليق الخلايا باستخدام محلول ألجينات مُسخن مسبقاً.

للقيام بذلك، قم بتوصيل حقنة سعة 20 milliliter بأنبوب بلاستيكي مرن واسحب ألجينات داخل الحقنة. بعد ذلك، اخلط معلق الخلايا برفق باستخدام الحقنة مع تجنب تكوين فقاعات. الآن، اسحب الخلايا داخل الحقنة.

تخلص من الأنابيب البلاستيكية ثم قم بتوصيل المحقنة بجهاز التغليف. انتقل بعد ذلك إلى إعداد الأدوات الخاصة بمولد الخرز، ومضخة المحقنة، ومقياس تدفق الهواء، وحمام ترسيب كلوريد الكالسيوم. تحقق من وجود فجوة بطول 10 centimeter بين نهاية جهاز التغليف ونقطة التجميع في طبق بتري.

بعد ذلك، اضبط مضخة السرنجة على 10 milliliters per hour. ومعدل تدفق الهواء على eight liters per minute، والضغط على 100 kilo pascals. اجمع الخلايا المغلفة في حمام ترسيب مسخن مسبقاً لمدة سبع دقائق.

بعد ذلك، انقلهما عن طريق الشفط اللطيف إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter يحتوي على 20 milliliters من 0.9%Sodium chloride، واترك الكبسولات تترسب في قاع الأنبوب، ثم تخلص من السائل الطافي بلطف، وبعد ذلك اغسلهما مرة واحدة باستخدام 0.9%Sodium chloride. انتقل إلى إعادة تعليق الخلايا المكبسلة في وسط زراعة مُدفأ مسبقاً، ومُدعم بمثبط الروك. انقل الخليط إلى قارورة زراعة واحضنه لمدة ثلاثة أيام.

قم باستزراع خلايا الخط السدوي للفئران PA six في قارورة T 75 مطلية بـ 0.1% gelatin، واستخدم وسط تمايز عصبي دوباميني مُكيف لمدة 24 ساعة. انقل الكبسولات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter واتركها تترسب في قاع الأنبوب. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الكبسولات في وسط تمايز عصبي دوباميني مُكيف بخلايا PA six.

المزرعة الوسطية. تُحضن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المغلفة مع طبقة أحادية من خلايا PA six لمدة 21 يوماً. مع تغيير الوسط عند تعويضه.

يتم استبدال نصف الوسط الغذائي في كل مرة لمواصلة استزراع خلايا PA six في عملية التمايز العصبي الدوباميني. يتم تزويد الوسط بعوامل تحريض لمدة أسبوع واحد. أولاً، قم بشفط الكبسولات ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter.

عندما تترسب الكبسولات في القاع، تخلص من السائل الطافي. اغسلها مرتين باستخدام DPBS، مع التخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، أضف خمسة milliliters من محلول decap ululating واخلط المعلق جيداً.

يُحضن المزيج لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد طرد الراسب مركزياً، يتم فصل الخلايا عن الأغطية (decap cells) وغسلها مرتين باستخدام DPBS، ثم تُستخدم هذه الخلايا إما في زراعة أحادية الطبقة أو للتحليل المباشر اللاحق. في التحضير النموذجي، يتراوح قطر الكبسولات الدقيقة من الألجينات بين 400 و500 microns.

هنا، تم استخدام مقايسة C-F-D-A-P-I. تحدد النتائج الخلايا المغلفة الحية الخضراء عند 80%؛ حيث تعمل تحليلات الحيوية، والتكاثر، والموت الخلوي المبرمج للخلايا الجذعية الجنينية البشرية المغلفة في نقاط زمنية مختلفة على تحسين ظروف الزرع. ومن المثير للاهتمام أن تأثيرات مثبط rock تمنع الموت الخلوي المبرمج الناجم عن التفكك وتحافظ على حيوية الخلايا، مع الإشارة إلى نمو فائق للخلايا الجذعية الجنينية البشرية المغلفة المزروعة في H-F-F-C-M بالإضافة إلى ri.

يُطبق هذا المثال عملية تغليف الخلايا كمنصة ثلاثية الأبعاد لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المغلفة إلى عصبونات دوپامينية. وكما كان متوقعاً، يزداد حجم الأجسام الجنينية مع مرور الوقت؛ وتُظهر الخلايا بعد إزالة التغليف مورفولوجيا عصبونية تدريجية بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الزرع، مع نسبة حيوية تتجاوز 90%. ويشير تحليل التعبير الجيني إلى انخفاض في تنظيم العلامة متعددة القدرات OCT four.

ومن المهم الإشارة إلى أن علامة السلائف العصبية PAC six وعلامة العصبونات الدوبامينية th تظل مرتفعة التعبير بعد سبعة أيام من التمايز. وتشير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي خضعت لمزيد من التمايز إلى وجود عصبونات موجبة لـ TH بنسبة تزيد عن 90% بعد 21 يوماً. ويؤكد تحليل Western loss أنماط التعبير المواتية لـ TH و PAC six في أنظمة الزراعة الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) مقارنة بأنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد (2D).

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بفعالية في غضون ساعتين. تذكر معالجة الخلايا بمثبط rock قبل التغليف وبعده. يمكن استخدام محفزات أو مثبطات متنوعة لتخصيص بروتوكول التمايز ثلاثي الأبعاد (3D) للتجارب المستقبلية.

تعتمد هذه التقنية المحددة على تغليف الخلايا الجذعية embryonal stem cells البشرية وتمايزها ضمن بيئة ثلاثية الأبعاد (3D)، وذلك لاستكشاف إمكانيات استخدامها في العلاج الخلوي لعدد من الأمراض، لا سيما مرض باركنسون.