Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

نوضح في هذا الإجراء نهج المجهر الحيوي الكمي لتقييم ديناميكيات مرور الطفيليات عبر الطحال. في نموذج الملاريا لدى القوارض، يتم تحضير الفئران المصابة بطفيليات معدلة وراثياً ببروتين GFP لإجراء التصوير المجهري الحيوي؛ حيث تتيح قسطرة الوريد الطحالي حقن الصبغات الحيوية. وخلال التجربة، يتم تصوير الخلايا الفلورية أثناء تحركها في مناطق مختلفة من الطحال.

نقدم المنهجية لوصف حركية الطفيليات في الحجيرة البطيئة ثلاثية الأبعاد للُّب الأحمر وحساب تدفق الدم في الأوعية. وقد استُخدمت هذه المعاملات لمقارنة ديناميكيات الطحال لسلالتين من PULE. مرحباً بالجميع.

اسمي ناندو إل بورتيلو، وأحد الأسئلة البحثية الرئيسية في مختبري هو محاولة فهم دور الطحال في مرض الملاريا. يعد تضخم الطحال من العلامات المميزة لهذا المرض، ولكن بسبب العقبات التقنية والأخلاقية، فإن محاولة إجراء دراسات على هذا العضو أمر صعب للغاية. ولتحقيق ذلك، قمنا بتطوير تقنيات تتيح لنا رؤية المرور الديناميكي لهذا الطفيلي وقياس هذه الظاهرة كمياً.

هذا ما ستوضحه لورينا وMI في هذه البروتوكولات. يُجرى هذا البحث جزئياً بالتعاون مع مجموعات الدكتور لير من جامعة هامبورغ في ألمانيا والدكتورة ماريا كبو هنا في المستشفى العيادي، وقد حصل على تمويل عام من مؤسسة Cellex ووزارة CIA. تبدأ العدوى من المتبرع M المصاب بطفيليات GFP، سواء كانت قاتلة أو غير قاتلة، بنسبة 10% من الطفيليات. وللتحقق من وجود الطفيليات، يتم أخذ قطرة صغيرة من الدم من وريد ذيل الفأر وبسطها على المجهر.

قم بإجراء صبغ قياسي للمسحة باستخدام محلول GIMs. سيتيح هذا المحلول رؤية خلايا الدم الحمراء المصابة بمجرد جفافها؛ قم بتثبيت لطخة الدم باستخدام الميثانول لمدة دقيقتين، ثم ضع محلول GIMs واتركها للحضانة لمدة 20 دقيقة. اغسل الشريحة بمياه الصنبور الجارية ثم جففها، وقم بحساب النسبة المئوية لخلايا الدم الحمراء المصابة من إجمالي خلايا الدم الحمراء باستخدام مجهر ضوئي وعدسة شيئية زيتية بقوة تكبير 100x.

قم بتعريض الفئران للعدوى باستخدام طفيليات قاتلة أو غير قاتلة يتم الحصول عليها من دم الذيل لفئران مانحة ومخففة في PBS. اضبط الجرعة بحيث يتم حقن نصف مليون طفيلي لكل فأر للوصول إلى نسبة طفيليات محيطية تبلغ 1% في اليوم الثالث بعد العدوى، ويتم الحقن عن طريق التجويف البريتوني. وكبديل لذلك، يمكن استخدام خلايا دم حمراء RBCs موسومة بـ FITC في مجموعة الضبط.

يتم جمع واحد ملليلتر من الدم الشرياني من فأر، ثم غسل الراسب عن طريق الطرد المركزي في محلول PBS يحتوي على EDTA، ومن ثم إعادة تعليقه في محلول FITC وتحضينه لمدة ساعتين في الظلام مع الرج الخفيف. بعد انقضاء هذا الوقت، تتم إزالة السائل الطافي عن طريق الطرد المركزي والغسل بشكل مكثف. ثم يُحقن في فأر ضابط ليصل إلى متوسط 1% في الدورة الدموية الطرفية، ومن ثم البدء في التجارب الحيوية (in vivo).

مرحباً، أنا ميجا. لتصوير الطحال داخل الجسم الحي، نحتاج إلى إجراء جراحة صغيرة للحيوان لكشف الطحال؛ وبالطبع، تعلمت هذه التقنية من ستيفاني جي آر في مختبر وركر هيسلر، التي أود أن أشكرها، والآن سأوضح لكم كيفية المضي قدماً.

تم إجراء تصوير لعين الفأر المصابة في اليوم الثالث بعد العدوى عندما بلغت نسبة التطفل 1% في كلا السلالتين. حافظ على تخدير الفأر وفي درجة حرارة منظمة طوال الإجراء. احمِ العينين من الجفاف وتحقق من تخدير الفأر تماماً عن طريق وخز وسادة القدم قبل البدء وذلك لتسهيل الإعطاء الوريدي للمواد.

أثناء سير التجربة، قم بتنبيب وريد ذيل الفأر لتركيب القنية. أدخل إبرة صغيرة في أحد طرفي الأنبوب والمطبق الخاص بها في الطرف الآخر. املأ القنية بمحلول ملحي فسيولوجي مع إزالة الفقاعات، وتحقق من تدفق المحلول بشكل صحيح عبر القنية.

سيتم تركيب قنية في الوريد الجانبي للذيل بعد تنظيفه. عزز رؤية الوريد عن طريق إجراء تضييق خفيف عند قاعدة الذيل. أدخل طرف القنية داخل الوريد.

سيشير ظهور الدم إلى أن الإبرة في وضعية صحيحة. إذا لم يكن الأمر كذلك، كرر عملية القسطرة في الجزء العلوي من الوريد، ثم ثبت القُنّيلة في الذيل باستخدام الغراء والشريط اللاصق. قم بكشف الجزء السفلي من الطحال من خلال إجراء شق صغير في الجلد والعضلات في الجانب الظهري الأيسر للحيوان.

ضع الطحال في موضع يقل فيه تأثير حركة التنفس، وضع محلول PBS على السطح المكشوف للحفاظ عليه رطباً ونظيفاً من شعر الفأر. قم بتغطية الطحال بغطاء شفاف للسماح برؤيته. مرحباً، اسمي لورينا.

سيتيح لنا البروتوكول الموضح تصور حركة طفيليات PULI عبر الطحال. وقد كان ذلك ممكناً بفضل الطفيليات المعدلة وراثياً ببروتين GFP. تبرع بها جيمس بيرنز من جامعة دريكسل.

سيتيح لنا تصوير حركة الطفيليات الفلورية معرفة ما إذا كانت هناك اختلافات في السلوك بين السلالات الفتاكة وغير الفتاكة. أُجريت تجارب المجهر الحيوي باستخدام مجهر Leica متعدد الفوتونات، والمجهز بنظام تحضين مع تحكم في درجة الحرارة وعدسة شيئية غليسيرول 63x. ضع الحيوان على منصة المجهر مع توجيه غطاء شرائح الطحال لأسفل باتجاه العدسة الشيئية في البداية.

سيوفر تصوير الطحال بتكبيرات منخفضة رؤية عامة للبنية الدورية الدقيقة للعضو. عند تركيز الرؤية على الطحال باستخدام الفلورة الذاتية للأنسجة، يمكن ملاحظة طفيليات GFP وهي تمر عبر المناطق المختلفة من الطحال. مرحباً، اسمي ماريا ألبو من المراكز العلمية والتكنولوجية بجامعة برشلونة، وسنقوم بإجراء تصوير حي داخل الجسم للطحال.

من أجل دراسة تدفق الدم وحركية خلايا الدم الحمراء المصابة، سنستخدم مجهراً بؤرياً (confocal microscope) مجهزاً بماسح رنيني يتيح التصوير عالي السرعة، وهو أمر مفيد جداً لتجنب تأثير حركة العضو. هذا المجهر طيفي يتيح اختيار نطاق الرؤية. ولأجل التصوير بسرعة فائقة، سنقوم بعملية استحواذ متزامنة لعلامتي الفلوريسين والانعكاس.

اختر مناطق مختلفة للتصوير بمساعدة خلايا RBC، والانعكاس، والتباين، وأصباغ Vidal لإثبات وجود الأوعية الدموية الدقيقة في الطحال. سنشرح الآن كيفية قياس حركية الطفيليات في تدفق الدم الوعائي باستخدام مجهر Vidal وبرنامج Image J لتتبع حركة الطفيليات في الشبكة ثلاثية الأبعاد للب لب الأحمر. قم بالتقاط الصور عبر خمسة أعماق Z باستخدام وضع مسح عالي السرعة.

قم بتحويل مجموعات الصور المتراكمة إلى مقاطع فيديو ملونة مرمزة حسب المحور Z لتسهيل تتبع الخلايا الفلورية المفردة. تتوفر معلومات تفصيلية في النص حول تتبع الجسيمات المختلفة بمرور الوقت وعبر العمق في كل فيديو باستخدام إحداثيات X و Y و Z و T. يمكن حساب بارامترات الحركية، مثل الاتجاهية ومتوسط السرعة ووقت الاستبقاء، وتمثيلها كخرائط توزيع لتمكين التحليل المقارن بين مجموعات السلالات. يمكن تصوير التدفق الوعائي في الطحال عن طريق الحقن الجهازي لعدة جزيئات فلورية موصوفة في الجدول المساعد مثل dextrin.

وباستخدام مسح تباين الانعكاس لكرات الدم الحمراء الداخلية، يتم مسح تدفق الدم في الخط المركزي عن طريق وضع الأوعية أفقياً في اتجاه مسح الليزر واستخدام متوسط الخط المعزز. وفي هذه الصور، ستُستخدم الخطوط الناتجة عن الخلايا المتحركة لحساب تدفق الدم؛ لذا يتم التقاط صور لأوعية ذات أقطار مختلفة وعلى مدار الدورة القلبية للتعويض عن التقلبات. لطالما اعتُبر الطحال بمثابة صندوق أسود في أبحاث الملاريا، وقد طورنا هنا نهجاً كمياً بالمجهر الحي لزيادة الفهم حول ديناميكيات عدوى الطفيليات وتدفق الدم في هذا العضو، مما يتيح لنا معالجة أسئلة بيولوجية هامة مثل التصاق كرات الدم الحمراء المصابة بالطحال داخل الجسم الحي.

شكراً لكم و.